荷叶多酚的提取工艺优化及抗氧化研究

张俊伟，董树国，仲 乙，金 瑛*，姜英子*

(1.延边大学药学院，吉林 延吉 133000；2.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

荷叶是一种兼有食用、药用、观赏价值的植物[1]。荷叶是传统药膳当中经常选用的原料,在药用和食用两个方面全部均有着广泛的应用,早在1991年，荷叶被列为第二批既是食品又是药品的名单之中。荷叶中所含有的化学成分十分复杂，至今为止，已经从荷叶中分离出了多酚、生物碱、黄酮、有机酸、挥发油、皂苷等多种化学成分[2]。

多酚是植物中的一类重要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、防治糖尿病等生物活性作用，在食品、医药等领域有着广泛的应用[3- 4]。本实验在单因素实验的基础上利用正交试验优化荷叶多酚的提取条件，并利用邻苯三酚自氧化法和Fenton法对提取的荷叶多酚的抗氧化性进行研究，为荷叶中生物活性成分的深入研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ESJ200- 4B电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)；T6新世纪可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；RE- 3000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ- D循环水式多用真空泵(巩义市英峪子华仪器厂)；KQ- 250DE超声波清洗仪(昆明市超声有限公司)。

荷叶(购于吉林大药房)；福林酚试剂；没食子酸标准品(纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇、无水碳酸钠、三羟甲基甲烷(Tris试剂)、邻苯三酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁均为分析纯，过氧化氢(浓度为30%)。

1.2 荷叶多酚的提取工艺优化

1.2.1荷叶多酚的提取

准确称取粉碎好的荷叶3.0 g,放入100 mL具塞锥形瓶中,按一定的固液比加入乙醇水溶液浸泡荷叶,再放入超生清洗仪内提取一段时间,取出锥形瓶后进行抽滤。滤渣以同样的条件再提取2次，合并3次提取的滤液，浓缩后转入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。置于冰箱中备用。

1.2.2单因素实验

选取提取时间、提取温度、固液比和乙醇水溶液的浓度作为单因素实验考察因素，按照试验方法“1.2.1”进行提取。

1.2.3荷叶多酚提取工艺的正交实验设计

根据单因素实验结果，选取提取时间、提取温度、固液比和乙醇水溶液的浓度4个因素作为考察因素，以荷叶中多酚的提取率为考察指标，利用L9(34)正交试验进行提取工艺优化。

1.3 荷叶多酚的含量测定

1.3.1标准曲线绘制

配制浓度为2.0 g/L的没食子酸标准溶液，逐级稀释得到浓度为10、20、30、40、50 mg/L的对照品溶液。各溶液精密量取1 mL稀释液，依次加入0.5 mL福林酚试剂，静置2 min后加入2 mL 7.5%的碳酸钠溶液2 mL定容到10 mL，用蒸馏水做空白对照，在600 nm波长处测定吸光值。以吸光度A为纵坐标、浓度C为横坐标绘制标准曲线，并拟合出回归方程：A=184.2C-0.017 8，R2=0.999 3。表明在浓度为10～50 mg/L的范围内吸光度与对照品浓度呈良好线性关系。

1.3.2样品多酚含量测定及得率计算

取荷叶提取液1.0 mL,按照方法“1.3.1”处理样品，在紫外分光光度计上于波长600 nm处测定吸光度值,计算荷叶中多酚的得率。

1.4 荷叶多酚的抗氧化性研究

1.4.1清除超氧阴离子的能力

在5个10 mL容量瓶中分别加入pH 8.2的Tris- HCL缓冲液0.5 mL。分别加入不同浓度的荷叶多酚的提取液，混匀后于25 ℃下预热20 min，再加入25 mmol/L的邻苯三酚0.5 mL，混匀后在25 ℃水浴中15 min，加入1滴浓盐酸终止反应。在波长325 nm处测定其吸光度，平行测定3次计算其平均值。在另一容量瓶中以0.5mL蒸馏水代替邻苯三酚溶液，重复上述过程，测得吸光度。再取一个容量瓶以蒸馏水代替荷叶多酚提取液，按上述过程测定吸光度，计算超氧阴离子自由基的清除率[5]。

1.4.2清除羟基自由基能力

取7个10 mL容量瓶，在1号瓶中加入0.5 mL 7.5 mmol/L邻二氮菲溶液，之后再加入0.5 mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液和0.5 mL 7.5 mmol/L的硫酸亚铁溶液，再加入0.5 mL 0.1%的双氧水，用蒸馏水定容，在40 ℃下水浴1.0 h，在波长536 nm处测吸光度值。在2、3、4、5、6号容量瓶中分别加入不同浓度的荷叶多酚提取液，再按照1号瓶的操作过程进行操作，测得吸光度值。7号容量瓶中不加荷叶多酚提取物及双氧水，再按照1号瓶的操作过程进行操作，测得吸光度值。计算羟基自由基清除率[6]。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1提取时间对荷叶多酚得率的影响

结果表明，随着提取时间的增长，荷叶多酚的提取率也在升高，但提取时间在15 min时荷叶多酚的提取率最高，超过15 min后荷叶多酚的提取率反而降低。因此提取时间为15 min时荷叶中的多酚可达到最高的提取率。

2.1.2提取温度对荷叶多酚提取率的影响

结果表明，随着温度的升高，荷叶多酚的提取率在上升，但是超过40 ℃后荷叶多酚的提取率逐渐降低，温度过高可能会使荷叶中的多酚结构产生影响反而降低荷叶多酚的提取率。所以荷叶多酚的提取率在提取温度为40 ℃时达到最大。

2.1.3料液比对荷叶多酚提取率的影响

结果表明，固液比越大，荷叶多酚的提取率也越大，但在固液比1∶12时达到荷叶多酚提取率的最大值，再增加固液比反而使荷叶多酚的提取率降低，即固液比为1∶12时荷叶多酚的提取率达到最大。

2.1.4乙醇溶液浓度对荷叶多酚得率的影响

乙醇浓度增加有利于荷叶多酚得提取，但同时会增加一些杂质的溶出从而导致多酚得率的减小。乙醇浓度对荷叶多酚得率的影响结果表明，随着乙醇水溶液浓度的升高，荷叶多酚的得率也升高，当乙醇浓度为60%时荷叶多酚的得率达到最大，乙醇浓度再增加时荷叶多酚的得率反而下降。

2.2 荷叶多酚的提取工艺优化

根据单因素实验结果，多酚得率为考察指标，选取最高的每个因素的3个水平进行正交试验设计。其中表1为水平表，表2为正交试验直观分析表，表3为正交试验方差分析表。结果表明影响荷叶多酚提取效果各因素的主次顺序为提取温度>乙醇浓度>提取时间>料液比。根据极差分析得到可以得出最佳提取工艺条件为A3B3C3D2，即超声温度50 ℃，超声20 min，料液比1∶12，乙醇浓度60%。在最佳工艺条件下，多酚得率为14.03 mg/g。

表 1 正交因素水平表

表 2 正交实验结果表

表 3 正交试验结果方差分析表

2.3 清除超氧阴离子自由基能力

荷叶多酚对超氧阴离子自由基的清除率结果见图1。由图1可知荷叶多酚对超氧阴离子拥有清除能力，荷叶多酚在浓度为0.1～0.25 g/L时，随着荷叶多酚浓度增加，超氧阴离子的清除能力增大较快，浓度超过0.25 g/L后清除超氧离子的能力增大逐渐趋于平缓。

2.4 清除羟基自由基的能力

荷叶多酚清除羟基自由基的能力的结果见图2。由图2可知在荷叶多酚浓度为0.1～0.20 g/L时，对羟基自由基的清除能力随着荷叶多酚浓度增加而明显增大，当浓度超过0.20 g/L时，荷叶多酚浓度增大对羟基自由基的清除能力虽然增加，但是增加的幅度变化较小。

3 结 论

通过正交实验对荷叶多酚的超声波提取工艺进行优化,结果表明影响荷叶多酚提取效果各因素的主次顺序为提取温度>提取时间>乙醇浓度>料液比。根据极差分析得到可以得出最佳提取工艺条件为A3B3C3D2，即超声温度50 ℃，超声20 min，料液比1∶12，乙醇浓度60%。在最佳工艺条件下，多酚得率为14.03 mg/g。利用邻苯三酚自氧化与Fenton法对荷叶多酚的抗氧化活性性进行评价，结果表明荷叶多酚对超氧阴离子和羟基自由基都拥有较强的清除能力,清除率分别为69.7%和66.8%。