沉默SIAH1基因对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响

贾前伟，雷小平，税民鸿，王 伟

0 引言

白内障作为与年龄密切相关的疾病，随着我国老龄化进程的加快，其发病率不断升高，已成为致盲的主要因素之一[1]，给中老年人群健康带来严重威胁。目前，该病发生机制尚未完全清楚，有研究指出，晶状体上皮细胞凋亡是白内障发生的始动因素和病理基础[2]。研究表明，H2O2诱导的氧化应激损伤可加速晶状体上皮细胞凋亡[3]。SIAH1作为一种E3泛素连接酶，具有蛋白泛素化和水解酶功能，在调控细胞凋亡中发挥重要作用[4]，研究发现，过表达SIAH1可触发细胞凋亡[5]。本研究利用H2O2构建人晶状体上皮细胞氧化应激损伤模型，采用小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术沉默细胞中SIAH1基因表达，观察其对细胞凋亡的影响，探讨可能的机制，以期为白内障机制研究及临床防治提供基础资料。

1 材料和方法

1.1材料HLE-B3细胞系购自上海子实生物科技有限公司；DMEM培养液、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、胎牛血清购自美国Hyclone公司；H2O2购自美国Sigma公司；Lipfectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；siRNA-SIAH1和阴性对照序列(siRNA-NC)由上海吉玛制药技术有限公司设计合成；总RNA提取试剂购自北京百奥莱博科技有限公司；反转录和PCR试剂购自日本TaKaRa公司；SIAH1和内参引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成；噻唑蓝(MTT)购自北京诺博莱德科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自上海基尔顿生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司；兔抗人p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和p-p38 MAPK多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组取HLE-B3细胞，用高糖DMEM培养液重悬，接种于6孔板，2×105个/孔，随机分为4组：(1)正常组：置于培养皿中，用含5% CO2、37℃培养箱培养48h；(2)H2O2组：置于培养皿中，用含400μmol/L H2O2的培养液在含5% CO2、37℃培养箱培养48h；(3)H2O2+siR-SIAH1组：待正常组细胞融合度在80%以上时，胰蛋白酶消化，传代培养。取对数生长期细胞，按照Lipfectamine 2000转染试剂说明转染SIAH1干扰序列：siRNA1：5’-UUGAGGACGGAGGAATACATUAAA-3’，siRNA2：5’-UAAAUGUCCUUCGUGGUCCAA-3’，培养24h，图1实时荧光定量PCR技术检测细胞中SIAH1基因表达。

随后，用含400μmol/L H2O2的培养液在含5% CO2、37℃培养箱培养48h；(4)siR-NC组：按照H2O2+siR-SIAH1组的方法转染阴性对照序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’，培养24h，随后，用含400μmol/L H2O2的培养液在含5% CO2、37℃培养箱培养48h。

1.2.2实时荧光定量PCR技术检测细胞中SIAH1基因表达取各组细胞，胰酶消化，细胞裂解液裂解，用总RNA提取试剂提取细胞中总RNA并检测纯度，反转录成cDNA，用实时荧光定量PCR仪按扩增试剂盒说明对引物扩增。引物序列：SIAH1：上游：5’-AGCCGTCAGACTGCTACAG-3’，下游：5’-AAAAGACTCGCCAAGTCATTGT-3’；GAPDH：上游：5’-TGGTCACCAGGGCTGCTT-3’，下游：5’-AGCTTCCCGTTCTCAGCCTT-3’。条件：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，连续循环36次，每个样品设复孔6个，2-△△Ct法计算各组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率取各组细胞，胰酶消化，1000r/min离心10min，取细胞沉淀，预冷PBS冲洗3次，再次离心，弃去上清液，加入结合缓冲液200μL，并调整细胞密度为2×105个/mL，加入Annexin V-FITC和PI液各5μL，避光反应20min，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.4 Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白的表达取各组细胞，胰酶消化，加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，4℃下10000r/min离心15min，提取总蛋白并检测浓度。取50μg总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转膜，室温下用脱脂奶粉封闭60min，加入一抗兔抗人p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bcl-2、Bax抗体，4℃过夜孵育，加入二抗，室温反应60min，TBST冲洗3次，暗室下加入ECL反应15min，拍照。用Image J分析软件对灰度值进行分析，以GAPDH为内参获得目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1各组细胞中SIAH1基因表达正常组、H2O2组、siR-NC组和H2O2+siR-SIAH1组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量分别为1.02±0.03、2.76±0.07、2.73±0.04和1.58±0.05，差异有统计学意义(F=1737.066，P<0.01)；H2O2组、siR-NC组和H2O2+siR-SIAH1组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量均高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)，H2O2组和siR-NC组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量无差异(P=0.295)，H2O2+siR-SIAH1组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量低于H2O2组和siR-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05),见图1。

2.2各组细胞凋亡率正常组、H2O2组、siR-NC组和H2O2+siR-SIAH1组细胞凋亡率分别为(5.76±0.81)%、(14.85±2.40)%、(15.87±2.69)%和(9.24±2.47)%，差异有统计学意义(F=27.695，P<0.01)，H2O2组、siR-NC组和H2O2+siR-SIAH1组细胞凋亡率均高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)，H2O2组和siR-NC组细胞凋亡率无差异(P=0.433)，H2O2+siR-SIAH1组细胞凋亡率低于H2O2组和siR-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 A：正常组；B：H2O2组；C：siR-NC组；C：H2O2+siR-SIAH1组。

表1 各组细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bcl-2和Bax蛋白表达

注：aP<0.05vs正常组；cP<0.05vsH2O2组；eP<0.05vssiR-NC组。

图3 Western blot法检测细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bcl-2和Bax蛋白表达。

2.3各组细胞中凋亡相关蛋白的表达H2O2组、siR-NC组和H2O2+siR-SIAH1组细胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表达量低于正常组，而p-p38 MAPK和Bax蛋白表达量高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)，H2O2+siR-SIAH1组细胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表达量高于H2O2组和siR-NC组，而p-p38 MAPK和Bax蛋白表达量低于H2O2组和siR-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1，图3。

3 讨论

白内障作为中老年人群眼部高发疾病，发病与年龄密切相关[6]，主要表现为进行性晶状体混浊，阻碍了光线正常射入，是导致视力低下和失明的主要原因[7]，给中老年人群生存质量带来严重威胁。因此，研究探讨该病发生及进展机制，对该病综合防治及提高中老年人群生存质量意义重大。研究发现，晶状体上皮细胞在维持晶状体稳定、纤维透明性及正常功能中发挥重要作用[8]。而内外因素导致的氧化应激刺激可改变晶状体上皮细胞结构，促进其凋亡，使细胞骨架降解、加速蛋白在晶状体聚集，从而引发白内障[9-10]。SIAH1作为SIAH家族成员，可表达于多种正常组织中，而在多种肿瘤组织中表达缺失[11]，可能是一种肿瘤抑制因子，近年研究发现，SIAH1基因过表达可促进细胞凋亡[12]。SIAH1可能通过调控细胞有丝分裂[13]或JNK信号通路[14]而在细胞凋亡中发挥重要作用。

本研究参照文献[15]的方法利用H2O2诱导HLE-B3细胞凋亡模型，结果显示，H2O2组细胞凋亡率明显高于正常组，提示模型构建成功。进一步研究显示，H2O2组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量明显高于正常组，说明SIAH1可能参与了H2O2诱导的HLE-B3细胞凋亡过程。我们利用转染SIAH1 siRNA的方法下调HLE-B3细胞中SIAH1基因表达，结果显示，H2O2+siR-SIAH1组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量显著低于H2O2组和siR-NC组，说明HLE-B3细胞中SIAH1基因表达被成功抑制。p38 MAPK作为重要的MAPK信号通路，其激活与促进细胞凋亡密切相关[16]，在内外环境刺激下，活化的p38 MAPK可诱导Bax发生转位，而抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax表达失调是触发线粒体依赖的经典细胞凋亡途径的关键[17]。本研究结果显示，siR-NC组和H2O2+siR-SIAH1组细胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表达量低于正常组，而p-p38 MAPK和Bax蛋白表达量高于正常组，H2O2+siR-SIAH1组细胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表达量高于H2O2组和siR-NC组，而p-p38 MAPK和Bax蛋白表达量低于H2O2组和siR-NC组，说明p38 MAPK活化介导的凋亡通路可能参与了HLE-B3细胞凋亡，而下调SIAH1基因表达则可抑制p38 MAPK活化，提示SIAH1基因可能通过活化p38 MAPK信号通路而参与了HLE-B3细胞凋亡过程。

综上所述，下调SIAH1基因表达可抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡，其机制可能与抑制p38 MAPK信号通路活化有关，有望为白内障综合防治提供新的潜在靶点。