铁死亡的机制及其与非酒精性脂肪肝病的关系

陈 冉，刘 阳

1.辽宁中医药大学(辽宁 沈阳 110000) 2.辽宁中医药大学附属医院(辽宁 沈阳 110000)

非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是一种以肝脏脂质变性为特征的慢性进展性病变，包括单纯脂肪肝变性，脂肪肝炎，最终可能发展为肝硬化和肝癌，是当今世界最常见的慢性肝脏疾病。近年来，对NAFLD发病机制的研究包括“二次打击学说”及“多次平行打击学说”，认为发病与炎症、氧化应激、胰岛素抵抗、脂质代谢失调、肥胖，内质网应激等多种因素相关[1]。目前认为肝细胞和肝内巨噬细胞的铁死亡可能会导致单纯性脂肪肝变性向脂肪肝炎发展(NASH)，抑制铁死亡在未来可能成为NAFLD的一种新的治疗策略。本文系统性地总结了铁死亡的机制以及铁死亡是如何参与NAFLD的发展过程中，旨在指导认识这种新的细胞死亡形式以及它在NAFLD发病中的作用，为NAFLD的发病机制研究和治疗靶点提供一定的参考。

1 铁死亡机制

细胞死亡根据独特的形态特征被划分为3类：凋亡，自噬和坏死。随着生物科学领域的深入研究发现许多形式的不受调控的坏死实际上也遵循某些细胞死亡程序，具有独特的分子模式和代谢特征，其中包括坏死性凋亡、细胞焦亡、依赖性细胞死亡、嵌入性死亡、亲环素D介导的细胞死亡等[2]。2012年Dixon教授在癌症细胞中发现了新的细胞死亡形式，其特征是细胞内致死性的铁依赖的脂质活性氧的蓄积，同时伴随着谷胱甘肽(GSH)依赖的脂质过氧化修复系统的破坏，被命名为铁死亡[3]。铁死亡有着复杂的基因、蛋白、代谢调控网络，谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)，半胱氨酸，GSH，胱氨酸/谷氨酸逆向转运体(Xc-)系统，多不饱和脂肪酸(PUFA)，脂氧合酶(LOX)等参与到铁死亡中。

1.1铁-脂质过氧化的发生机制铁是人体必须的微量元素，循环中的铁以三价铁(Fe3+)形式存在，Fe3+在一些酶和转运蛋白的作用下进入到细胞质和线粒体基质变成具有氧化还原活性的二价铁(Fe2+)，形成一个不稳定铁池，细胞内过多的铁通常储存在铁蛋白中。溶酶体中包含不稳定的铁池、铁蛋白和含铁细胞器的代谢分解产物，这些具有氧化还原活性的铁会通过芬顿反应催化产生活性氧(ROS)，铁依赖产生的ROS与脂质发生过氧化反应，从而诱导细胞铁死亡。Xie等[4]认为除了通过芬顿反应产生ROS之外，烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADPH)依赖的脂质过氧化以及GSH消耗诱导的GPX4失活所导致的脂质过氧化也参与到铁死亡中。因此，铁吸收增多和铁储存减少都可以导致铁超载，通过铁螯合剂抑制铁超载可以抑制铁死亡。

在脂质代谢组学研究中发现铁死亡过程中PUFAs是最容易发生氧化的脂质，它包括花生四烯酸(AA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)等，其中AA是铁死亡过程中最常见被消耗的PUFA。PUFAs存在于多种细胞膜中，例如视网膜细胞，精子细胞，它们对致死性的氧化应激反应很敏感[5]。PUFAs存在易被提取氢原子的双烯丙基质子，氢提取产生的烷基自由基容易与分子氧发生反应，产生过氧化氢自由基，随后与其他PUFAs发生反应，形成脂质过氧化连锁反应[6]。这一过程主要受LOX的调控，LOX从PUFAs的双烯丙基位置提取氢原子，然后加入分子氧，使PUFAs被催化发生酶促氧化反应，因此在特定情况下(如GSH的消耗、GPX4的失活)LOX对PUFAs氧化与铁死亡相关。当使用氘化PUFAs(D-PUFAs)替换天然的PUFAs(H-PUFAs),氘取代了双烯丙基位置，可以明显减慢氘的提取和活性氧的形成[7]。此外，Yang等[6]还发现通过小干扰RNA(siRNAs)抑制LOX的活性可以预防铁死亡诱导剂erastin诱导的铁死亡。

1.2Xc-/GSH/GPX4轴在抗铁-脂质过氧化中的作用在地球生物的进化过程中，由于光合作用的产生逐渐形成稳定的含氧大气层，导致含PUFA的生物不可避免会发生脂质过氧化反应，因此抗脂质过氧化反应系统也随之适应性的发展。在正常情况下，脂质过氧化防御系统能够预防细胞免受脂质氧化应激损害，维持细胞内稳态。当脂质过氧化防御系统遭到破坏时，会导致铁死亡发生。Seibt等[8]认为系统性Xc-/GSH/GPX4轴参与到抵消内源性铁-脂质过氧化依赖的细胞死亡途径中，影响该轴的任何一个环节都可以引发细胞铁死亡。系统性Xc-作为该轴最上游部分，主要负责高度特异性摄取胱氨酸，其后胱氨酸被GSH或硫氧还蛋白还原酶1还原为半胱氨酸，半胱氨酸反过来合成GSH[9]。GSH是哺乳动物细胞和组织中的主要抗氧化剂，是GPX4的辅助因子，因此阻碍细胞内半胱氨酸水平会影响GSH水平，随后直接影响GPX4的活性，从而增加对铁死亡的敏感性。GPX4是铁死亡主要调节者，它是一种脂质修复酶，可以利用GSH将潜在毒性的脂质过氧化氢(L-OOH)转化为无毒的脂质醇(L-OH)，因此能够减少复杂的氢过氧化物产生从而干扰脂质过氧化链式反应[10]。

GPX4家族是人类抗氧化防御的主要组成部分，一共包括8个亚型，其中GPX1-GPX4以及GPX6都属于硒蛋白，这些酶的组织分布及对底物特异性氧化降解各不相同，GPX4能够减少脂质过氧化反应并控制铁死亡[11]。硒在生物体中以第21氨基酸硒半胱氨酸形式发挥重要作用，硒半胱氨酸是GPX4的活性位点，能保护哺乳动物精子免受氧自由基损害，因为GPX4是线粒体细胞膜的构成成分，通过嵌入精子线粒体中稳定精子结构[12]。Yant等[13]通过GPX4+/-小鼠证实了在硒充足的情况下，仅保留部分有活性的GSH不会损害精子功能。GPX4-/-小鼠会导致早期胚胎致死，而GPX4+/-小鼠在断奶后因严重癫痫致死，这些研究反应了含硒的GPX4对于哺乳动物多系统的发育至关重要[14]。因此，很多研究者认为GPX4可能是铁死亡的关键。

无论是细胞内铁超载，还是Xc-/GSH/GPX4轴为核心的抗脂质过氧化系统的失调均可能导致细胞铁死亡，GSH的耗竭和GPX4的失活被认为是铁死亡显著的特点。铁死亡可能与铁-活性氧(ROS)依赖的脂质过氧化系统和以Xc-/GSH/GPX4轴为核心的抗脂质过氧化系统的失调相关。近年来发现了很多与这两个系统相关的一些分子靶点也参与到铁死亡进程中，例如参与到铁代谢的蛋白包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，铁代谢主要调节因子铁反应元件结合蛋白2(IREB2)、磷酸化酶激酶G2(PHKG2)等，还有待于进一步研究。

2 铁死亡与NAFLD的关系

2019年Tsurusaki等[15]首次证实了铁死亡可能触发了单纯脂肪肝变性的炎症反应，从而促进了NASH的发生和发展，通过胆碱缺乏和补充乙硫氨酸饮食建立了NAFLD动物模型，观察到NAFLD小鼠发展为NASH的起始阶段肝细胞铁死亡先于细胞凋亡，导致了肝脏损害，免疫细胞浸润和炎症反应，并且显示铁螯合剂和抗氧化剂能够几乎完全逆转NASH初期疾病模型的肝细胞死亡，抑制炎症反应和脂质过氧化反应，改善肝功能。Qi等[16]研究发现，铁死亡是NASH发展的关键因素，能够加重NASH早期阶段的炎症反应、氧化应激和细胞损伤。脂质积累导致的氧化应激反应已经被证实是NASH的重要致病因素，这可能由于NASH与铁死亡有着共同的病理因素。另外，在某些NASH患者中检测到铁的沉积，由于代谢损伤导致的铁的蓄积增加被认为是加重NASH的因素，通过去铁疗法可以改善肝功能损害，降低血清丙氨酸氨基转移酶的水平[17]。

Li等[18]最新研究发现蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的NASH小鼠中AA代谢相关基因和铁代谢的关键调控因子明显上升，值得注意的是Fe2+是铁死亡关键因素，而AA是铁死亡中最常见的PUFA，Fe2+水平增加可能和AA代谢的增加协同反应产生了脂质过氧化，促进NASH的发展。使用Ferrostatin-1(Fer-1)和Liproxstain-1(Lip-1)处理MCD饮食小鼠，显著改善了肝脏损伤、炎症和纤维化，并减少了肝脏脂肪滴和TG的蓄积，降低了非酒精性脂肪肝(NAS)分数。而在NASH体外模型中抑制GPX4的表达，发现脂肪滴和脂质ROS的表达增加，而过表达GPX4可显著抑制脂肪滴的增加，进一步证明了脂质活性氧增加了肝内脂肪滴积累，GPX4可能在NASH进展过程中对脂肪滴稳态起重要作用。肝脏作为GPX4表达最高的组织，当小鼠肝细胞中缺乏GPX4时，会引起肝细胞变性造成小鼠死亡，因此GPX4通过保护肝脏免受脂质过氧化作用，对于肝脏功能和肝细胞存活至关重要[19]。

在慢性NASH阶段，存在多种细胞死亡类型，包括凋亡，坏死和铁死亡等，针对多种细胞死亡类型的药物可能是治疗NASH的理想选择。例如维生素E，可以抗脂质过氧化，改善肝细胞变性，抑制细胞凋亡和铁死亡。罗格列酮是一种临床常用的噻唑烷二酮类增敏剂，能高选择性的激活过氧化物酶增殖物受体(PPAR-y)，调节脂质代谢，减少肝内脂肪蓄积，近年来发现[20]罗格列酮同时是酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)抑制剂，具有抑制铁死亡的作用，罗格列酮被报道具有致癌风险可能与该机制相关，因为抑制ACSL4会降低癌细胞对铁死亡的敏感性[20]。因此，对于2型糖尿病(T2DM)合并NAFLD患者使用罗格列酮可能是一个很好的选择。

3 铁死亡调节

3.1铁死亡诱导剂常用的铁死亡诱导剂有：①系统性Xc-抑制剂，主要通过抑制胱氨酸的摄入，导致GSH的耗竭，包括erastin、聚乙烯磷脂、imidazole ketone erastin(IKE)、柳氮磺吡啶、索拉非尼、谷氨酸盐等；②GPX4抑制剂，通过抑制或消耗GPX4诱导铁死亡，包括RSL3、ML162,DPI化合物7,10,12,13,17,18,19等；③GSH抑制剂，通过消耗GSH诱导铁死亡，包括BSO、DPI2、顺铂等；④其它特殊类型，如FINO2、他汀类、枸橼酸铁铵。

3.2铁死亡抑制剂①抗氧化剂，通过阻止脂质过氧化或(和)抑制脂氧合酶来抑制铁死亡，包括维生素E、α-生育酚、氘化多不饱和脂肪酸、铁抑素、脂蛋白他汀、辅酶Q10、丁羟甲苯等；②铁螯合剂，通过铁的消耗阻断铁依赖的脂质过氧化，包括去铁胺、去铁酮；③LOX抑制剂，通过阻断LOX诱导的脂质过氧化抑制铁死亡，包括CDC、PD-146176、多西苯醌等；④硒制剂，通过补充硒增加硒蛋白丰度以抑制铁死亡；⑤ACSL4抑制剂，抑制ACSL4抑制游离脂肪酸转变为脂肪辅酶a酯，从而抑制铁死亡，如吡格列酮。

3.3中医中药近年来发现中药也能发挥调节铁死亡作用。李艳纯等[21]研究发现二氢青蒿素能够抑制细胞内GSH、GPX4蛋白水平，从而诱导肝癌发生铁死亡，抑制肝癌细胞增殖。Chen等[22]发现二氢青蒿素能通过增加ROS，消耗GPX4诱导神经胶质瘤细胞发生铁中毒。Song等[23]发现麦冬提取物皂苷元能够通过增加细胞内铁浓度和ROS的水平诱导胰腺癌细胞铁死亡。在体外和活体实验研究中发现丹参提取物二氢异丹参酮I能够通过抑制GPX4的水平诱导乳腺癌细胞铁死亡，抑制瘤体增长[24]。Jiang等[25]研究表明天麻素通过Nrf2/HO-1通路改善谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞的铁死亡。Guerrero等[26]证明铁死亡在横纹肌溶解引起的急性肾损伤中发挥关键作用，姜黄素能够抑制肾小管细胞铁死亡，减少GPX4的消耗和脂质过氧化水平以及炎症反应。目前中医药针对铁死亡的研究仍以肿瘤和神经退行性病变为主，很多药物都证实有诱导或抑制铁死亡的作用。中药是否可以通过抑制铁死亡延缓NAFLD的进展，还需要进一步探索和挖掘。

4 总结

铁死亡在触发NAFLD向NASH发展中可能起到了关键作用，可能是预防NAFLD发展的一个潜在治疗靶点。目前关于铁死亡和NAFLD的实验研究比较少，目前对于两者之间的关系知之甚少，例如通过抑制铁死亡治疗NAFLD是否具有临床可行性，其具体药物如何选择及其有何副作用和不良结局，是否可以发挥天然药物多靶点双向调节等机制寻求相关治疗措施，铁死亡在NAFLD的单纯脂肪变性阶段、慢性炎症阶段、纤维化阶段或肝硬化阶段是否发挥作用等问题还有待于进一步研究。