浓香型白酒窖泥中一株产己酸功能菌的研究

张 超，李俊薇，刘占奇，孙 琳，董孝元，李 瑞

（1.黄鹤楼酒业有限公司，湖北武汉 430050；2.武汉雅仕博科技有限公司，湖北武汉 430050）

白酒中的有机酸可以调节白酒口味使酒体醇和爽口，不同的有机酸与醇在各种微生物酶的催化作用下生成不同的酯。其中己酸乙酯作为浓香型白酒的主体香是判定浓香型白酒质量等级的关键指标[1]。浓香型白酒采用全泥窖发酵模式，因而窖泥的质量也就成为影响浓香型白酒质量的关键因素之一，而窖泥中微生物的种类与数量又决定着窖泥的质量，环环相扣密不可分[2]。窖泥中的微生物以细菌为主，尤其以芽孢杆菌为多，生长繁殖需严格厌氧环境且生长速度缓慢[3]。现阶段借助于一代测序技术，可以从16S rDNA序列分析入手对微生物进行种属的鉴定，对微生物的研究更加深入。因此，开展对产己酸微生物的选育、培养及应用研究，对于提高浓香型白酒质量有着非常重要的现实意义。

本研究从黄鹤楼酒业浓香型白酒窖泥着手，筛选关键功能微生物，进行单菌株发酵鉴定，并对发酵液的己酸等有机酸定量分析，为浓香型白酒生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：窖泥，样本取自黄鹤楼酒业浓香窖池。

富集培养基（巴氏合成培养基）：醋酸钠0.5%，硫酸镁0.02 %，硫酸铵0.05 %，酵母浸粉0.1 %，磷酸氢二钾0.04%，pH5.8～7.0,121 ℃灭菌20 min，接种前加入无水乙醇2%。

分离培养基：在富集培养基中加入琼脂2 %，碳酸钙2%。

仪器设备：DZF-6050B真空培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；显微镜EclipseE100；DYY-6D型电泳仪，北京市六一仪器厂；TC-96/GPCR扩增仪；ChampGel5000凝胶成像仪。

1.2 实验方法

1.2.1 富集培养[4]

样品预处理：称取1 g优质窖泥，加入装有100 mL无菌水的三角瓶中，以180 r/min振荡30 min后在80 ℃恒温水浴锅中处理10 min以消除非芽孢菌体，在预热过程中不断晃动三角瓶避免局部受热[5]。冷却至30～40 ℃，无菌条件下吸取1 mL样品液于20 mL富集培养基，加入2 %（体积分数）无水乙醇进行试管培养，用500 μL液体石蜡封住培养基液面以隔绝外部空气[6]，用胶塞封口，置于真空干燥箱中，抽真空0.08 MPa左右，充入N2以此循环2次，在34 ℃下恒温培养10 d，观察试管内菌液产气情况。

1.2.2 分离纯化

将富集培养后的菌液再进行80 ℃水浴热处理10 min。在无菌室中用无菌吸管吸取菌液1 mL，放入盛有9 mL无菌水的吸管中，依次稀释到10-3，取10-1、10-2、10-33个稀释度的稀释液与50 ℃分离培养基混合倒板、摇匀，34 ℃培养3～5 d。

将不同形态的单菌落分别接种于20 mL巴氏液态培养基中培养15 d，观察产气情况以及对培养液定性分析确定有己酸。反复进行3次单菌纯化工作，确认为纯种后可进行保藏[7]。

1.2.3 定性鉴定及镜检

吸取2 mL混合均匀的己酸培养液，加入2%硫酸铜溶液2 mL，然后再加1 mL乙醚后充分振荡混合均匀，静置分层后观察乙醚层颜色。如果乙醚层呈蓝绿色，则证明菌液中含有己酸，且颜色越深己酸含量越高[8]。

1.2.4 分子生物学鉴定

DNA提取[9]：使用上海生工单菌株基因组试剂盒提取DNA。

PCR扩增[10-11]：采用引物27F/1492R对Z-1进行16S rDNA扩增。

引物序列：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')。

1492R：(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')。

PCR反应体系（20 μL）：dH2O 3.5 μL；Primer（2 μM）5 μL，2× Direct PCR Mix 10 μL；基因组DNA 1 μL；Taq酶0.5 μL。

PCR扩增条件：

取5 μL反应液进行1 %琼脂糖凝胶（120 V，25 min）电泳，使用Marker DL2000。

1.2.5 己酸测定

1.2.5.1 定性分析

方法同1.2.3。

1.2.5.2 定量分析[12]

GC检测条件：检测器：氢离子火焰检测器；色谱柱：DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

温度程序：50 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至230 ℃保持2 min；检测器温度230 ℃；载气He，流速1 mL/min。

液体样品处理：吸取3 mL发酵液样品在10000 r/min、4 ℃条件下离心5 min，通过滤膜过滤后吸取1 mL滤液到含有100 μL 2-乙基丁酸（1.010 g/L）的10 mL容量瓶中，并用体积分数为1%的甲酸定容至刻度，混合均匀后吸取1 μL进行气相色谱测定。

2 结果与分析

2.1 产己酸菌分离结果

通过多次分离纯化，共分离得到2株产己酸菌，分别记为Z-1、Z-2，菌株特征见表1和图1所示，均为革兰氏阳性微生物；两株微生物的定性显色反应如图2所示；从图1可以看出，菌株Z-1产己酸量高于Z-2，在试验中优选Z-1做理想菌株保存。

表1 菌落形态及显微形态

图1 镜检图(10×100）

图2 定性显色图

2.2 菌种分子生物学鉴定

提取菌株Z-1基因组DNA，然后以基因组DNA为模板对16S rDNA进行扩增，其琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，为单一条带、明亮条带，1.4 kb左右。

图3 菌种基因组DNA PCR产物电泳图

将菌株Z-1的16S rDNA（1464bp）序列输入美国国家生物技术信息中心(NCBI) 数据库中做BLAST分析，与GenBank数据库中同源性最高的已知分类菌株序列进行比较，菌株Z-1与Aneurinibacillus migulanus同源性最高为99%，因此可以鉴定菌株Z-1为Aneurinibacillus migulanus[13]，测序结果见表2。

2.3 己酸测定分析

2.3.1 定性测定

微生物产己酸定性显色反应结果如图4，经3次转接后Z-1显色效果良好。

2.3.2 定量测定（图5）

从图5可以得出，利用气相色谱法可以一次性测出发酵液中的己酸、丁酸等有机酸含量。Z-1发酵液样品中检测出己酸含量为3.5 g/L，丁酸含量1.12 g/L。

表2 Z-1测序结果

图4 定性显色图

图5 Z-1发酵液色谱图

3 讨论

本试验通过对黄鹤楼酒业浓香型白酒窖泥进行微生物分离纯化，鉴定出1株高产己酸的硫胺素芽孢杆菌，并利用气相色谱对单菌株发酵液进行己酸定量测定，其产己酸量达3.5 g/L。

但关于硫胺素芽孢杆菌[14-15]的生长规律方面还有待进一步研究，根据菌株的生长规律可有针对性的应用于实际生产中。在后期应用于窖池养护与窖泥制作过程中，要注意其生长阶段的选取，这样可以有效缩短发酵期。