功能菌养窖液中己酸产生途径的证实及其在生产中的应用

程 凡，张温清，梅 婕，周 萍

（安徽宣酒集团股份有限公司科研中心，安徽宣城242000）

浓香型白酒主要以高粱、小麦、大米、糯米、玉米为原料，经固态发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成，具有己酸乙酯为主体的复合香气，其“窖香优雅、绵甜爽净、酒体柔和、协调”的风格特点深受消费者喜爱[1]。老窖出佳品，窖池越老，产酒的质量越好，这是浓香型白酒传统工艺的经验总结。随着酿酒科技不断进步，研究表明，老窖泥中己酸菌等厌氧功能菌在白酒的发酵生香中起着不可代替的作用[2]。

目前，对于己酸菌的研究主要集中在窖池微生态系统中新型高效己酸菌的筛选、发酵条件调控、己酸代谢途径解析、己酸菌在浓香型白酒酿造及其他领域的应用等[3-4]。本实验用于制作功能菌养窖液的微生物是以己酸菌为主的一组菌群，均选育自江南小窖酿造微生态系统，并保藏于本实验室。目前，该组功能菌已用于日常功能菌养窖液的制作，养窖液中己酸的含量获得了较大的提升，实际应用结果良好，大大提高了浓香型原酒的品质。因此，研究功能菌养窖液中高含量己酸的产生途径，找到进一步提升养窖液中己酸的方法，有重要的实际意义和行业推广价值。本研究采用液相色谱法和气相色谱法连续跟踪功能菌养窖液发酵过程中乳酸、乙酸、丁酸和己酸等指标的变化，并通过生物信息学手段，采用PAST软件对样品中各有机酸指标进行相关性分析，找出己酸的合成底物，推测己酸的合成途径，最后通过不同底物添加实验证实己酸的合成途径。本研究得出乳酸、乙酸、丁酸、己酸之间具有显著的相关性，证实了窖泥功能菌液以乳酸为底物合成己酸，乙酸、丁酸为其中间代谢产物，提高己酸菌的乳酸耐受，提高初始配方中乳酸的含量或选用高乳酸含量的黄水，是提高窖泥功能菌养窖液中己酸的重要手段。本研究为探究己酸菌代谢途径，改良人工窖泥功能菌的制作工艺，加快人工窖泥老熟时间，提高人工窖泥的品质提供全新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品收集

己酸功能菌养窖液由本厂微生物制品中心提供，菌液混匀后，调节pH7.0，37℃密闭培养；添加实验以乳酸0 g/L、5 g/L、10 g/L 3个浓度梯度添加（实际添加量以分析数据为准），取培养0 d、3 d、6 d、7 d的菌液为分析样品。

1.1.2 试剂及耗材

乙醇（色谱纯），二氯甲烷（色谱纯），甲酸（色谱纯），乙腈（色谱纯），乙酸、丁酸、己酸、乳酸等标准品（纯度≥90%）；MRS培养基、营养琼脂培养基均购自上海安谱实验科技股份有限公司；实验室用水由实验室专用纯水机制备。

1.1.3 仪器设备

气相色谱仪，日本SHIMADZU GC-2010 Plus，FID检测器，色谱柱AgilentDB-FFAP，30m×0.25mm；氢气发生器QPH-500Ⅱ型，空气发生器QPA-5LP型，上海全浦科学仪器有限公司；液相色谱仪，Agilent HPLC-1206，配DAD检测器，色谱柱Agilent Poroshell 120 EC C18；隔水式恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；离心机TG16-WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 试验方法

菌液样品前处理及色谱分析条件参考本团队之前的分析方法[5-6]。取分析样品10 mL于离心管中，8000 r/min离心20 min。取上清液待用。经稀释、水膜过滤后，采用HPLC-DAD测定菌液中乳酸的含量；其他挥发性香味成分，如己酸、乙酸、己酸乙酯等经萃取后，采用GC-FID进行测定。乳酸菌、己酸菌、细菌等微生物数量测定参照已报道的相关文献[7-8]。

2 结果与分析

2.1 功能菌养窖液制备过程中样品的指标分析

对功能菌养窖液不同发酵阶段的酸、酯及菌落各项指标跟踪测定，采用PAST软件对样品测定的数据进行相关性分析。r＞0.6表明具有相关性，±表示正负相关性；p＜0.05表示呈显著相关。其结果如表1所示。

表1 功能菌液中各指标相关性系数分析

由表1可知，己酸与培养时间、己酸乙酯、乙酸、丁酸呈正相关，与乳酸乙酯呈负相关，其中己酸与培养时间和丁酸呈显著相关性；乳酸与培养时间、己酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸呈负相关，与乳酸乙酯呈正相关，且乳酸与己酸呈显著相关性；功能菌液中的己酸菌平均分布与培养时间、己酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸呈负相关，己酸菌与乳酸乙酯、乳酸呈正相关，并且与培养时间、己酸乙酯、丁酸、己酸都具有显著相关性。

根据功能菌液制备过程中己酸菌分布情况分析，如图1所示，随着培养时间的延长，己酸菌与细菌总数降低，乳酸菌在发酵前期表现较强的生物活性；3 d以后，乳酸菌总数呈明显下降趋势，己酸菌总数逐渐上升，细菌总数重新恢复稳定，乙酸、丁酸、己酸含量稳定增长，如图2所示。

图1 功能菌液制备过程中微生物分布图

图2 功能菌养窖液制备过程中4种有机酸变化趋势

2.2 功能菌液乳酸添加实验

综合以上分析结果，己酸功能菌液在制备过程中必然存在乳酸、乙酸、丁酸和己酸四者之间的代谢关系。结合相关文献[2，4]，推测功能菌养窖液存在乳酸-乙酸-丁酸-己酸的代谢途径。为进一步明确功能菌液是否能利用乳酸为底物合成己酸，我们通过开展以下乳酸添加实验加以证实。

实验取入罐前的功能菌培养液，按照1.1.1所述添加乳酸纯物质，调节初始pH值为7.0，37℃密闭发酵6 d，同上，取培养0 d、3 d、6 d菌液，进行酸、酯等相关指标分析，结果如表2所示。不同浓度乳酸添加后，随着培养时间的延长，功能菌液中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯含量都呈下降趋势，乳酸乙酯稍有生成；发酵3 d，菌液中乳酸含量急剧降低，发酵6 d，乳酸全部被消耗；菌液中的乙酸在培养前3 d表现为初始乳酸含量越高，乙酸消耗越快，6 d后基本达到平衡；丁酸浓度保持持续升高状态，6 d后也基本保持数值稳定；己酸含量明显得到提升，且3个浓度添加试验的乳酸-己酸转化率分别为42.0%、46.5%和44.8%，说明乳酸最终全部转化为己酸，且明显提升了总酸含量。说明功能菌液发酵前期，受乳酸浓度的影响，乳酸、乙酸急速消耗，产生大量的丁酸和己酸；发酵后期伴随着乳酸的完全消耗，乙酸、丁酸含量逐渐趋于稳定，己酸含量达到最高峰。整个发酵过程中酯类物质的变化较小，其原因可能与功能菌液中醇类物质含量较低存在关系。综上所述，本次乳酸添加实验进一步证实了功能菌液中的己酸菌可以利用乳酸为发酵底物生成己酸，存在乳酸-乙酸-丁酸-己酸的微生物代谢途径。

表2 乳酸添加试验不同发酵时间功能菌液中相关物质分级结果

3 结果与讨论

本研究针对本厂分离优化的新型己酸功能菌养窖液中有机酸、酯等指标的综合分析，开展功能菌液中己酸代谢途径方面的研究，利用PAST软件对样品测定的数据进行相关性分析，再结合乳酸添加实验，证明了该己酸功能菌液可以利用以乳酸为底物生成己酸；也证实了以乳酸为底物，乙酸、丁酸为中间产物，己酸为终产物的发酵代谢途径。这项发现为白酒风味骨架成分己酸、己酸乙酯产生机理的研究和功能菌液生产工艺改进提供新的发展方向；而且本研究中所采用的新型己酸菌的加入不仅可以增加人工窖泥中己酸的产量，而且丰富了窖泥微生物群落；其平均44.4%的乳酸-己酸转化率为缩短人工窖泥老熟的培养时间，指导浓香型白酒窖泥老熟工艺的调整具有实际意义。此外，实际生产中有意识的提高培养液中底物乳酸的含量（或高乳酸含量黄水的用量），增加己酸功能菌群的底物耐受性，是快速、有效提高功能菌养窖液中己酸含量的有效手段，具有行业推广意义。