津酒老窖泥己酸菌的筛选及培养条件的优化

刘宏媛，李春旭，张锦涛，韩晓东，王津颖

（天津津酒集团有限公司，天津 300130）

在浓香型大曲酒的生产中，发酵窖池窖龄越长，产酒的酒质就越好，这是由于老窖中富含多种厌氧功能菌，它们参与浓香型白酒的生香过程[1]。浓香型白酒的主体香气成分是己酸乙酯，而己酸乙酯是靠己酸菌产己酸与乙醇作用而产生的，由此可见，窖泥中的己酸菌是生成己酸乙酯的主要来源，与出酒的品质有着紧密的联系[1，5]。为此，本实验对津酒老窖泥中的己酸菌进行分离纯化，并对其培养条件进行优化，以期为人工老窖泥的培育提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

材料：窖泥（采自天津津酒集团老窖池）。

试剂：乙酸钠、硫酸铵、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、蛋白胨、乙醇、混合内标液（2%叔戊醇，2%醋酸正戊醇，2%2-乙基正丁酸）等。

1.2 仪器与设备

手提式灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、FID 检测器，CDMC色谱工作站等。

1.3 培养基的制备

改良巴氏培养基[1]：乙醇20 mL(灭菌后，接种前添加)；硫酸铵0.5 g；乙酸钠5 g；磷酸氢二钾0.4 g；硫酸镁0.2 g；酵母膏1 g；碳酸钙10 g(灭菌后，接种前添加)；蛋白胨4 g；水1000 mL。

斜面的制作[2，5]：配制液体培养基，加琼脂3%～4%，加热融化后分装于各试管内，不超过试管高的1/5，加塞包扎后于0.1 MPa 灭菌30 min，置于无菌室冷却至约60 ℃，加入2%的酒精，趁热摆放斜面，待其凝固后置于真空干燥器中，抽真空至0.08 MPa，34 ℃恒温培养3 d，以检查灭菌是否彻底，如斜面有杂菌加以剔除。

1.4 己酸菌的分离纯化

1.4.1 种子液的制备[2-3]

称取1 g 优质老窖泥，加入液体培养基内，80 ℃水浴10 min，待冷却至30～40 ℃，于无菌条件下加入乙醇2～3 滴，加塞包扎，放置于真空干燥器内，抽真空至0.08 MPa，34 ℃培养7～10 d。

1.4.2 富集培养[3-4]

挑取产气较早、较多且气泡较大的试管，80 ℃水浴10 min，待冷却后按照15%的接种量接于装有液体培养基的试管内，培养条件参照1.4.1培养5 d。

1.4.3 平板分离

挑取产气多、气泡较大的试管，于80 ℃水浴10 min。在无菌的条件下，用一支1 mL 无菌吸管吸取己酸菌液1 mL，加入盛有9 mL 无菌水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从该试管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1～10-6不同稀释度的己酸菌液。取10-3～10-6浓度的菌液各1 mL，加入空培养皿中，倒入融化保温的固体培养基，手掌平托培养皿缓慢摇晃几圈，以使菌液与培养基混合均匀。待培养皿凝固后，培养条件参照1.4.1，培养3 d。

斜面转接：无菌条件下，挑选形态规则的菌落转接于试管斜面，培养条件参照1.4.1，培养3～5 d。

1.4.4 初筛

斜面试管抽真空培养3～5 d 后，有菌落长出，用灭菌后的接种针挑取少许菌落，置于滴有无菌水的载玻片上，于显微镜下观察，从中挑取游动活泼、长短杆状，最好是呈鼓锤状芽孢的菌株作为初筛菌株。

1.4.5 己酸定性检测

硫酸铜显色法：发酵液1 mL，置于试管中，加入乙醚0.5 mL，再加入2%硫酸铜溶液1 mL，充分摇动混匀，放置分层后，在两层中间呈蓝色即证明有己酸的存在，颜色越深，己酸的含量越高。

1.4.6 己酸菌培养液中己酸含量的检测

直接进样毛细管柱气相色谱法：分析白酒采用混合内标（2%叔戊醇，2%醋酸正戊醇，2%2-乙基正丁酸）来测定己酸菌液中的有机酸。

1.4.6.1 仪器及条件

FID检测器，CDMC色谱工作站。

色谱柱为毛细管柱PEG-20M，检测器温度250 ℃，汽化温度220 ℃。

程序温度：起始温度50 ℃，恒温2 min 后以3.5 ℃/min 速率升至200 ℃，继续恒温10 min，分流比40∶1。

1.4.6.2 样品处理

取样品50 mL，活性炭吸附，静置，过滤，取清滤液20 mL 加盐酸酸化至pH2，用无水乙醇稀释至40 mL，摇匀；于10 mL 具塞试管中准确移入10 mL处理后的样品，加入0.1%三内标混合液（10 mL×0.1=10 μL）摇匀，进样量为1 μL。

1.5 己酸菌培养条件的优化

选定酒精浓度（%vol）、pH 值、培养温度(℃)和蛋白胨含量(g/L)4 个因素为影响己酸菌生长的主要因素，构建4 因素4 水平的正交表，进行正交试验。在试验过程中采用血球计数板计数法对1 mL己酸菌液中的活菌数进行计算，采用直接进样毛细管柱气相色谱法对己酸菌液中己酸含量进行检测。因素水平表和正交试验表见表1、表2。

表1 培养因素水平表

2 结果与分析

2.1 窖泥中己酸菌的分离培养

对津酒窖泥中的己酸菌进行分离纯化，得到2株己酸菌，并命名为菌1、菌2，其菌落形态和镜检形态见表3。

2.2 己酸菌培养条件的优化结果

由硫酸铜显色法的初步检测可知，菌2 的己酸含量较高，因此选定菌2 为试验菌株；因素水平表参见表1，试验方案及结果见表2，试验结果分析见表4。

表2 试验方案及试验结果

表3 己酸菌的特征

由表4 可知，对于不同的指标而言，不同因素的影响程度是不一样的，不同指标的优选方案有所差别，通过综合平衡法可以得到综合的优方案，具体平衡过程如下：

因素A：对于己酸菌数量和己酸含量都是取A4为最佳水平。

因素B：对于己酸菌数量和己酸含量都是取B2为最佳水平。

因素C：对于己酸菌数量和己酸含量都是取C1为最佳水平。

因素D：对于己酸菌数量取D4好，对于己酸含量取D3好，因为对于己酸含量，因素D 为较重要因素，所以选取D3为最佳水平。

综上分析可知，最优方案为A4B2C1D3，即酒精浓度为3%vol、pH 值为6、培养温度34 ℃、蛋白胨含量为4 g/L为己酸菌2的最适生长条件。

3 结论

3.1 己酸菌孢子有耐热性，而营养细胞不耐热，因此为了纯化菌种，多采用热处理的方法，本试验采用80 ℃水浴的方法取得了较好的效果。

表4 己酸菌数量试验结果分析

3.2 己酸菌在偏酸性(pH6)的环境下生长旺盛；添加一定量的酒精(3%vol)即可起到选择性培养的作用，亦可促进己酸菌的生长；己酸菌在30～36 ℃均能生长，但在34 ℃时其生长最为旺盛；简化巴氏培养基中添加蛋白胨为笔者一次偶然试验所得，加入少量的蛋白胨可促进己酸菌的生长繁殖，这可能是因为蛋白胨营养较为丰富，含有多种适宜己酸菌生长的成分。由于试验条件所限，并未对此进行更深一步的探讨。

表5 己酸含量试验结果分析

3.3 己酸菌在白酒中的应用主要用于加快窖泥的老熟，从而提高出酒质量。本试验从津酒的窖泥中分离纯化出两株己酸菌，采用硫酸铜显色法对其己酸产量进行粗测，采用直接进样毛细管柱气相色谱法对己酸含量进行检测，结果见表5。并对其培养条件进行优化，以为后续人工老窖泥的培育、己酸菌液在窖泥中的养护等研究提供基础。