古顺大曲微生物群落结构的分析

姚 灿，张 倩，3， 张 霞，3，，杨 涛，李国友，王爱军，武志强

（1.中国科学院成都生物研究所，四川成都 610041；2.河北古顺酿酒股份有限公司，河北邢台 054000；3.中国科学院大学，北京 100049）

我国白酒酿造历史悠久，蒸馏酒的生产可追溯到西汉时期[1]。神曲酒是我国的历史名酒，唐代邢州神曲酒更是十分有名。北魏贾思勰的《齐民要术》中记载了一种“神曲”，其特色在于药曲，即在酒曲制作过程中加入野蓼、桑叶、荷叶等中药材。据《齐民要术》记载，“神曲”相较普通曲而言，具有发酵力强、发酵周期稍短的特点，即药材中的活性成分会影响大曲微生物生态，使得大曲中的功能微生物发生变化。此外，药材中的香味物质也可能会转移到酒体中，形成具有独特风味并含有健康功能因子的白酒。

大曲，素有“酒之骨”之称，蕴含丰富的微生物资源和酶系，是白酒酿造的驱动力，具有糖化、发酵、生香、呈味的作用[2]。近年来，研究人员利用高通量测序技术针对白酒大曲样品进行了一系列微生物群落结构的研究，发现微生物的群落结构分布与大曲品质密切相关[3]。夏玙等[4]结合实时荧光定量聚合酶链式反应和二代测序技术，研究了热风干燥工艺对贮存期大曲中真菌群落的影响。赵金松等[5]采用非可培养技术结合多元统计方法对大曲中的微生物群落和风味物质进行了相关性分析。徐占成等[6]运用宏基因组学技术对剑南春大曲真菌群落组成进行了深入研究。

为研究“神曲”与普通中高温大曲之间微生物群落组成的差异，本试验以河北古顺酿酒股份有限公司生产的普通中高温大曲、“神曲”普通曲和“神曲”荷叶曲为研究对象，利用高通量测序技术对3类古顺大曲进行深入分析，为“神曲”运用于白酒生产提供一定理论支撑和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

普通中高温大曲、“神曲”普通曲（加入野蓼、桑叶2 种中药材）和“神曲”荷叶曲（加入野蓼、桑叶、荷叶3 种中药材）（皆由河北古顺酿酒股份有限公司提供），DNA 提取试剂盒（ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit 1.3.0）和其他分子实验材料（由成都罗宁生物科技有限公司提供）。

1.2 实验方法

1.2.1 样本DNA提取

采用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit 1.3.0对样本的基因组DNA 进行抽提后，利用琼脂糖凝胶电泳对DNA纯度进行检测，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 PCR扩增

按指定测序区域，合成带有Barcode 的特异引物分别对样本的16S rDNA V4 区和ITS 2 区域进行扩增。

引物序列如下：

515F(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')；

806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')；

ITS3 KYO2(5'-GATGAAGAACGYAGYRAA-3')；

ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')；

PCR反应体系见参考文献[7]。

1.2.3 PCR产物定量

将样本的PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用胶回收试剂盒切胶回收PCR 产物，TE 缓冲液洗脱回收目标DNA 片段。参照电泳检测结果，将PCR 回收产物用Qubit 2.0（ThermoFisher 公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

1.2.4 文库构建与测序

使用试剂盒TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit 进行文库构建；采用PE250 测序方式，使用Hiseq Rapid SBS Kit v2 作为测序试剂盒、上机测序。

1.3 数据分析

原始数据经过拼接、过滤得到可供后续分析的高质量目标序列。在97%相似性水平上进行OTU（Operational Taxonomic Units）聚类并挑选出OTU的代表性序列，使用SILVA 数据库确定物种分类信息，获得细菌或真菌从门到属水平下的种类及相对丰度。

2 结果与分析

2.1 细菌群落组成分析

2.1.1 细菌门水平群落组成图（图1）

图1 表明，在3 类大曲（普通曲（PT）、“神曲”普通曲（SP）、“神曲”荷叶曲（SH））中，厚壁菌门（Firmicutes）与放线菌门（Actinobacteria）相对丰度总和均超过98.5%，细菌中厚壁菌门占绝对优势，相对丰度皆超过97.1%。表明3 类大曲的细菌群落结构在门水平上相似。

2.1.2 细菌属水平群落组成图（图2）

从属水平分类上，不同大曲中微生物的种类分析结果见图2。3 类大曲中，魏斯氏菌属（Weissella）、乳杆菌属（Lactobacillus）和片球菌属（Pediococcus）3 类微生物的相对丰度总和达到89.8%。魏斯氏菌属和乳杆菌属是3 类大曲中的优势物种，二者相对丰度总和超过83.4%。说明3 类古顺大曲中的细菌皆以乳酸菌为主要微生物。除上述3类微生物之外，肠球菌属（Enterococcus）、毛螺菌属（Lachnospiraceae）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、肾杆菌属（Renibacterium）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）等相对丰度较低的微生物在3类大曲中也被检测到。

2.2 真菌群落组成分析

2.2.1 真菌门水平群落组成图（图3）

基于真菌ITS 基因聚类分析，3 类大曲在门水平上的结果见图3。结果表明，子囊菌门（Ascomycota）与毛霉亚门（Mucoromycota）2类微生物是3类大曲中的优势微生物，二者相对丰度总和超过99.3%，其中子囊菌门占绝对优势，其相对丰度高达94.4%，在SH 中达到了96.3%；毛霉亚门的相对丰度则介于3.0%～4.9%之间。

2.2.2 真菌属水平群落组成图（图4）

在属水平上，3 类大曲的主要微生物结构分布如图4 所示。结果表明，热子囊菌属（Thermoascus）和曲霉属（Aspergillus）是PT、SP 和SH 中的优势真菌，其相对丰度总和分别占比93.3%、84.9%、56.4%；在3类大曲样品中，热子囊菌属的相对丰度范围为30.8%～74.2%，SP 与SH 接近（30.8%、33.7%），最大值出现于PT样品（74.2%）；曲霉属的相对丰度范围为19.1%～54.1%，PT 与SH 相接近（19.1%、22.7%），最大值出现在SP 样品（54.1%）。根毛霉菌属（Rhizomucor）在所有样品中的相对丰度差异较小（保持在3.5%左右）。根据方差分析（ANOVA）结果，嗜热真菌属（Thermomyces）在3 类大曲中有显著差异（p＜0.05），其在SH 样品的相对丰度达到36.7%，而在PT 样品中仅为0.3%，说明嗜热真菌属是SH样品中的主要真菌群类。

3 结论

大曲是白酒酿造的糖化发酵菌剂，是决定白酒出酒率及口感风味的关键所在，而大曲微生物又是决定大曲品质的核心因素之一[8-9]。本研究利用高通量测序技术对古顺3 类大曲的微生物群落结构进行了深入分析。结果表明，3 类大曲中的细菌主要为厚壁菌门，并以乳酸菌群为优势菌，“神曲”中的原核微生物的物种多样性及相对丰度与普通曲无显著差异；真菌则以子囊菌门为主，其中热子囊菌属和曲霉属是3 类大曲中共有的优势真菌，方差分析结果表明，嗜热真菌属在“神曲荷叶曲”中是主要真菌群类。谭崇尧等[10]对不同地域浓香型大曲微生物的分析结果中表明，长江中游和江淮地区的大曲中真菌主要为曲霉属，北方派有酵母和嗜热高温菌（热子囊菌属和嗜热真菌属）为主要优势菌的差异。由此可见，在真菌群落结构方面，古顺普通曲与以嗜热高温菌为优势菌的北方派相似；“神曲普通曲”则接近于以曲霉属为主的长江中游和江淮地区；而“神曲荷叶曲”（以热子囊菌属、曲霉属和嗜热真菌属为主要真菌群类）则更接近于以嗜热高温菌为主要优势菌的北方派。