牙龈卟啉单胞菌感染与口腔及食管鳞癌临床病理特征相关性分析

赵世杰，原 翔，刘怡文，杨海军，张耀文，冯连杰，周福有

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)是目前研究广泛且证据充足的重要牙周致病菌之一。口腔Pg感染与口腔鳞癌的相关性研究较多，已证明其与口腔鳞癌的发病呈正相关[1-2]。Gao等研究首次发现Pg感染与食管鳞癌的相关性[3]，提出酸性环境的变化对Pg的定植影响显著[4]。Pg在口腔、食管上、中、下段鳞癌组织中的定植分布状况如何？自上而下是否也有一定规律？其与患者临床病理特征及预后是否相关？本研究就针对上述问题研究总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集安阳市肿瘤医院(河南科技大学第四附属医院)口腔鳞癌及食管鳞癌术后石蜡组织207例，分为4组，口腔、食管胸上、中、下段鳞癌分别为50、50、57和50例。患者相应临床病理资料均来自病历资料。纳入标准：R0切除，T1-3NxM0。排除标准：术前行新辅助治疗(放疗、化疗、放化疗)，术前1个月内行抗炎治疗。该项目经过安阳市肿瘤医院伦理委员会审核同意。

1.2 方法所有鳞癌石蜡组织4 μm厚连续切片，免疫组织化学SP法染色观察。免疫组化SP超敏试剂盒购于中杉金桥公司，HRP标记山羊抗兔IgG抗体购于康为公司，山羊抗兔IgG(H+L)荧光抗体购于CST公司。

1.3 结果评估随机挑选5个高倍镜视野(400倍)，根据切片胞质及胞核着色的阳性细胞数以及着色面积进行评分，对组织切片的染色强度和染色面积进行半定量分析； 染色强度评分标准为：0分，未着色，阴性；1分，着色较弱，呈浅黄色，弱阳性；2分，中性着色，呈棕黄色，中度阳性；3分，着色较强，呈棕褐色，强阳性；染色面积评分标准为：阳性细胞0%～5%，0分；阳性细胞6%～25%，1分；阳性细胞25%～75%，2分；阳性细胞超过75%，3分；免疫组化评分计算方法：总得分=染色强度×染色面积。0分，阴性(-)；1～3分，弱阳性(+)；4～8分，中阳性(++)；9～12分，强阳性(+++)。实验结果统计标准：0分为阴性，>1分为阳性。

1.4 统计学方法使用SPSS 23.0软件进行统计学数据分析。计数资料以百分率(%)表示，Pg在不同组阳性率及与临床病理特征的比较采用χ2检验，Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并以Log-rank检验生存时间之间的差异。随访时间至2018年底, 以死亡为终点事件，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组免疫组化染色结果分析4组均有阳性表达率，Pg的阳性定位主要在鳞癌细胞的胞质中，呈棕黄色颗粒。口腔鳞癌组普遍以强阳性为主，食管胸上、中段鳞癌组普遍以中度阳性为主，食管胸下段鳞癌组普遍以弱阳性为主，免疫组化染色评分由上至下呈逐渐下降趋势，见图1。

图1 免疫组化染色结果(苏木素衬染，×400)

2.2 4组的免疫组化阳性率分析4组Pg阳性率存在差异，从解剖位置上分析由上到下阳性率递减，4组的阳性率依次为54.00%、48.00%、42.10%、40.00%，见图2。

2.3 Pg与口腔鳞癌临床病理特征的相关性及生存分析在口腔鳞癌组中Pg与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、临床分期与生存情况具有相关性，在肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、临床分期与生存方面Pg阴性组优于Pg阳性组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。生存分析显示：在口腔鳞癌患者中Pg阳性组的中位生存期为69个月，5 a生存率为44.40%。Pg阴性组中位生存未达到，5 a生存率为55.60%，Pg阳性组生存期低于Pg阴性组患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图2 口腔鳞癌与食管上、中、下段鳞癌Pg阳性率差异分析

表1 Pg与口腔鳞癌临床病理特征的相关性分析例(%)

临床病理特征Pg(+)Pg(-)χ2 P性别男12(48.00)13(52.00)女15(60.00)10(40.00)0.7250.395年龄<60岁10(66.70)5(33.30)≥60岁17(48.60)18(51.40)1.3840.239吸烟有8(47.10)9(52.90)无19(57.60)14(42.40)0.5000.480饮酒有4(40.00)6(60.00)无23(57.50)17(42.50)0.9860.321分化程度高分化18(54.50)15(45.50)中/低分化9(52.90)8(47.10)0.0120.914浸润深度<肌层5(29.40)12(70.60)≥肌层22(66.70)11(33.30)6.2690.012淋巴结转移有9(90.00)1(10.00)无18(45.00)22(55.00)6.5220.011临床分期Ⅰ/Ⅱ期11(35.50)20(64.50)Ⅲ/Ⅳ期16(84.20)3(15.80)11.260.001生存生存16(44.40)20(55.60)死亡11(78.60)3(21.40)4.7260.030

2.4 Pg与食管胸上段鳞癌临床病理特征的相关性及生存分析食管胸上段鳞癌组中Pg与饮酒、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期及生存具有相关性，在肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期及生存Pg阴性组优于Pg阳性组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。生存分析显示：在食管胸上段鳞癌患者中，Pg阳性组的中位生存期为29个月，5 a生存率为38.90%。Pg阴性组中位生存未达到，5 a生存率为61.10%。Pg阳性组生存期低于Pg阴性组患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图3 口腔鳞癌组生存分析

表2 Pg与食管胸上段鳞癌临床病理特征的相关性分析例(%)

临床病理特征Pg(+)Pg(-)χ2 P性别男17(54.80)14(45.20)女7(36.80)12(63.20)1.5290.216年龄<60岁8(72.70)3(27.30)≥60岁16(41.00)23(59.00)3.4550.063吸烟有14(50.00)14(50.00)无10(45.50)12(54.50)0.1020.749饮酒有13(65.00)7(35.00)无11(36.70)19(63.30)3.8600.049分化程度中/低分化22(51.20)21(48.80)高分化2(28.60)5(71.40)1.2310.267浸润深度<纤维膜4(25.00)12(75.00)≥纤维膜20(58.80)14(41.20)4.9870.026淋巴结转移有19(73.10)7(26.90)无5(20.80)19(79.20)13.6470.001临床分期Ⅰ/Ⅱ期1(9.10)10(90.90)Ⅲ/Ⅳ期23(59.00)16(41.00)8.5540.003生存生存14(38.90)22(61.10)死亡10(71.40)4(28.60)4.2760.039

2.5 Pg与食管胸中段鳞癌临床病理特征的相关性及生存分析在食管胸中段鳞癌组中Pg与年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移具有相关性，在肿瘤浸润深度、淋巴结转移方面Pg阴性组优于Pg阳性组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。由于所选病人均为2018年新诊断为食管癌病人，随访时间短，生存分析无意义。

图4 食管胸上段鳞癌组生存分析

表3 Pg与食胸中段鳞癌临床病理特征的相关性分析例(%)

临床病理特征Pg(+)Pg(-)χ2 P性别男17(47.20)19(52.80)女7(33.30)14(66.70)1.050.306年龄<60岁10(71.40)4(28.60)≥60岁14(32.60)29(67.40)6.5460.011吸烟有9(45.00)11(55.00)无15(40.50)22(59.50)0.1060.745饮酒有6(46.20)7(53.80)无18(40.90)26(59.10)0.1130.736分化程度低分化7(53.80)6(46.20)中/高分化17(38.60)27(61.40)0.9520.329浸润深度<纤维膜2(10.00)18(90.00)≥纤维膜22(59.50)15(40.50)13.0280.001淋巴结转移有22(64.70)12(35.30)无2(8.70)21(91.30)17.6560.001临床分期Ⅰ/Ⅱ期1(33.30)2(66.70)Ⅲ/Ⅳ期23(42.60)31(57.40)0.10.752生存生存23(41.10)33(58.90)死亡1(100.00)0(0.00)1.40.237

2.6 Pg与食管胸下段鳞癌临床病理特征的相关性及生存分析在食管胸下段鳞癌组中Pg与性别、饮酒、淋巴结转移、临床分期及生存具有相关性，在淋巴结转移、临床分期及生存方面，Pg阴性组优于Pg阳性组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。生存分析显示：在食管胸下段鳞癌患者中，Pg阳性组的中位生存期为40个月，5 a生存率为20.60%。Pg阴性组中位生存未达到，5 a生存率为79.40%。Pg阳性组生存期低于Pg阴性组患者，差异具有统计学意义(P<0.05),见图5。

表4 Pg与食管胸下段鳞癌临床病理特征的相关性分析 例(%)

临床病理特征Pg(+)Pg(-)χ2 P性别男20(45.50)24(54.50)女0(0)6(100.00)4.5450.033年龄<60岁10(45.50)12(54.50)≥60岁10(35.70)18(64.30)0.4870.485吸烟有11(50.00)11(50.00)无9(32.10)19(67.90)1.6370.201饮酒有10(71.40)4(28.60)无10(27.80)26(72.20)8.0030.005分化程度中/低分化18(40.90)26(59.10)高分化2(33.30)4(66.70)0.1260.722浸润深度<纤维膜4(36.40)7(63.60)≥纤维膜16(41.00)23(59.00)0.0780.780淋巴结转移有18(56.30)14(43.80)无2(11.10)16(88.90)9.780.002临床分期Ⅰ/Ⅱ期0(0)8(100.00)Ⅲ/Ⅳ期20(47.6)22(52.40)6.3490.012生存生存7(20.6)27(79.40)死亡13(81.3)3(18.80)16.6820.001

图5 食管胸下段鳞癌组生存分析

3 讨论

细菌感染与癌症发生发展的相关性是近年癌症研究热点之一，有关Pg在癌症发生发展的相关性研究也日渐增多。研究表明Pg感染与口腔鳞癌发生发展呈正相关[5]，Pg感染与多种消化道、呼吸道肿瘤的发生发展也有关[6-7]。Pg感染导致宿主细胞癌变的机制可能是多方面的，已知的如Pg可增加IL-6和STAT3活性，促进肿瘤发生[8]。Pg能上调微RNAs(micro-RNAs)，例如miR-203在牙龈上皮细胞中可以抑制凋亡等[6]。2016年高社干等[3]首次研究已提示Pg感染可能是食管鳞癌一个新的危险因素，应作为食管鳞癌的预后生物标志物之一。

本研究结果显示Pg在口腔、食管上、中、下段癌组织中均有一定的检出率。从口腔到食管胸下段鳞癌组，Pg的检出率从上而下依次递减，免疫组化染色评分由上至下也呈逐渐下降趋势。考虑与Pg不耐酸性环境，而从口腔至食管下段接触胃酸的机会逐渐增加有关。通过对Pg与食管胸上、中、下段3组鳞癌的临床病理特征的相关性进行分析，纵向比较结果显示：在食管胸上段鳞癌组中，Pg与饮酒、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期及生存具有显著相关性；在食管胸中段鳞癌组中，Pg与年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移具有显著相关性；在食管胸下段鳞癌组中，Pg与性别、饮酒、淋巴结转移、临床分期及生存具有显著相关性，并且各组中Pg阳性组在以上相关因素中均较Pg阴性组差，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

通过纵向比较发现，在肿瘤浸润深度方面，食管胸上段鳞癌组浸润深度达到或超过纤维膜的Pg检出率58.00%，明显高于下段组的41.00%，差异具有统计学意义(P<0.05)；中段与下段无差别(P>0.05)；在淋巴结转移方面，食管上段鳞癌组中发生淋巴结转移的Pg检出率73.10%，食管胸中段组64.70%，食管下段组56.30%。3组发生淋巴结转移的比例由上到下逐渐下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。在临床分期方面，分期为Ⅲ/Ⅳ期的食管上、中、下段鳞癌组的Pg检出率分别为59.00%、42.60%和47.60%，上、下段差异具有统计学意义(P<0.05)，中、下段无统计学差异(P>0.05)。Pg在口腔和食管鳞癌组织中的感染率和肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期3个方面的相关性分析，均提示Pg感染是促进肿瘤发生发展的危险因素，生存分析也提示Pg感染者预后较差。

本研究结果表明：Pg感染在口腔和食管鳞癌的发生发展中具有明显的促进作用，可能是口腔和食管鳞癌发生发展的重要危险因素，并可能作为评价其恶性程度和预后的生物标志物之一；防治Pg感染可能会改善口腔和食管鳞癌的治疗效果及预后。上述结论有待于进一步的基础和临床研究证据支持。