牙龈卟啉单胞菌通过上调S100A2促进食管鳞癌的侵袭性

焦叶林，刘其伟，阮豪杰，陈 攀，许海军，李孟祥，齐义军，高社干

食管鳞癌(Esophageal squamous cell cancer, ESCC)是全球食管癌的主要组织学类型[1]，是中国癌症死亡四大原因之一，占所有食管癌90%以上[2]。由于大多数患者在最初诊断时已经发生了转移，尽管接受了多种治疗方案，ESCC患者的5 a总生存率仅有10%[3]。因此，寻求预防、早期诊断和靶向治疗的分子标志物至关重要。

慢性感染是肿瘤形成与发展的重要因素之一，约有20%肿瘤与感染相关[4-5]。口腔牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)不仅能够引起牙周炎，还与多种全身性疾病密切相关。P.gingivalis富集于ESCC组织并与ESCC低分化、淋巴结转移及预后不良显著相关，提示P.gingivalis可能促进了ESCC演进过程[6]。P.gingivalis感染ESCC细胞前后共鉴定出255个差异表达蛋白质分子，其中S100A2表达上调。本研究进一步分析了ESCC组织中P.gingivalis与S100A2表达一致性，并探讨了S100A2沉默后阻断P.gingivalis对ESCC的促进作用。

1 材料和方法

1.1 实验试剂RPMI 1640培养基(Hyclone，货号 SH30809.01B)，胎牛血清(Hyclone，货号SV30184.02)，GAM细菌培养基(日水制业株式会社，货号05433)，RIPA裂解液(Sigma，货号R0278)，Bradford蛋白定量试剂盒(康为，货号CW0013)，PVDF膜(Millipore)，显色液ECL(康为，CW0049A)，β-actin抗兔一抗(CST，货号4970S)，S100A2抗兔一抗(Abcam，货号ab109494)，HRP标记羊抗兔二抗(Earth，货号110581)，细胞侵袭迁移实验使用Transwell迁移小室(Corning，货号3422)，Transwell浸润小室(BD，货号354480)，细胞转染siRNAs由上海吉玛公司合成生产，免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)采用链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶连接法，DAB(索莱宝，货号DA1010)。

1.2 细胞株、菌株和组织来源本研究中ESCC细胞系KYSE70细胞由本实验室冻存，P.gingivalisATCC 33277来源于ATCC细胞库，ESCC组织标本来源于河南科技大学第一附属医院2012年至2017年47例ESCC 患者手术标本。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养KYSE70用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，实验所使用的细胞均处于对数生长期。

1.3.2P.gingivalis培养和感染P.gingivalis用GAM培养基、37 ℃厌氧条件下(85% N2,10% H2和CO2)培养。P.gingivalis感染细胞用MOI 10。

1.3.3 细胞增殖、迁移、侵袭实验于96孔板每孔接种2000个，每组3复孔，分别在P.gingivalis感染后4、6、8、12、24、48、72 h终止培养，用MTT法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线。细胞迁移和侵袭实验采用迁移小室，小室上层接种5.0×104个细胞，培养24～48 h后终止实验，固定、0.2%结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野计数。

1.3.4 细胞转染实验siS100A2细胞转染，5 pmol siRNAs和8 μL siRNA-mate混合、室温孵育10 min，然后加入目标细胞，继续培养48～72 h。

1.3.5 蛋白提取细胞培养至收集时，预冷PBS洗3次，加入适量蛋白裂解液，冰上静置5 min，用细胞刮收集细胞于Ep管，4 ℃、13 000 r·min-1离心10 min，收集上清即提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，-20 ℃保存备用。

1.3.6 Western-bloting配制5%浓缩胶和12%分离胶，蛋白样品30 μg电泳分离，电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃过夜孵育，二抗室温孵育1 h，ECL显色。

1.3.7 免疫组化采用链霉素抗生素蛋白—过氧化物酶连接法，PBS 1∶500稀释S100A2一抗，DAB显色、苏木素复染检测组织表达。

1.4 统计学处理统计学分析均采用SPSS 17.0统计学软件分析，免疫组化结果分析采用卡方检验，检验水准为P<0.05。

2 结果

2.1P.gingivalis诱导S100A2蛋白水平上调P.gingivalis感染ESCC细胞24 h后，Western blot检测到ESCC细胞KYSE70中S100A2蛋白表达明显上调(见图1)。

2.2 S100A2沉默阻断了P.gingivalis诱导的ESCC细胞的恶性生物学行为siS100A2转染后，MTT细胞增殖实验(图2A)、迁移实验(图2B)和侵袭实验(图2C)检测对照细胞和siS100A2转染KYSE70细胞增殖、迁移和侵袭能力，发现P.gingivalis感染明显增强对照细胞的增殖、迁移和侵袭能力，转染siS100A2的KYSE70细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显降低，均有统计学意义(P<0.01)。

2.3 ESCC组织中S100A2表达及S100A2与P.gingivalis丰度相关性IHC检测47例ESCC组织中S100A2表达，发现ESCC组织中S100A2的表达(图3A)明显高于癌旁(图3B)。卡方分析ESCC中S100A2表达与P.gingivalis相关性，统计学分析结果显示ESCC中S100A2表达与P.gingivalis丰度呈正相关，P<0.01(图3B)。

图2 P. gingivalis感染KYSE70细胞、siS100A2转染后KYSE70及对照细胞增殖(A)、迁移(B)和侵袭能力(C)变化

图3 IHC检测ESCC组织中S100A2表达和P. gingivalis丰度(A)、S100A2和P. gingivalis相关性(B)

3 讨论

由于ESCC早期阶段缺乏典型临床症状，目前尚缺乏特异、敏感的ESCC肿瘤标志物分子，而食管胃镜筛查患者依从性差，并且还需专业医务人员，因此，大多数ESCC患者首次就诊时已发展至中晚期，大于50%中晚期病人就诊时已呈现出影像学可见的转移灶[7-9]。因此，明确ESCC病因、鉴定ESCC分子标志物，是有效预防ESCC发生、降低ESCC发生率、提高早期诊断ESCC及靶向治疗的基础。

上消化道微生态紊乱是ESCC 发生发展的重要因素之一[4-6]。正常的食管微生态主要由以链球菌为主的革兰氏阳性菌构成，而食管炎或Barrett’s食管的微生态以革兰氏阴性的厌氧菌为主[10]。流行病学研究表明，口腔P.gingivalis丰度与ESCC发生风险呈正相关，并且ESCC患者口腔微生态多样性显著减少[7-11]。ESCC组织中P.gingivalis丰度明显高于癌旁组织，并且与淋巴结转移呈正相关，与分化程度、生存期呈负相关。

S100A2是 S100 蛋白家族中重要成员，其表达异常与多种肿瘤发生发展相关。S100A2基因位于与上皮细胞分化有关的染色体 1q.21，具有多种生物学功能，如蛋白磷酸化、细胞支架构建及细胞内外钙离子平衡等[12]。此外，研究者也发现 S100A2的异常表达与肿瘤的演进过程相关，如：胃癌中S100A2表达缺失可导致肿瘤的发生，并与肿瘤大小、分化、淋巴转移及预后有关[12-13]。然而，与之相反的是，在大肠癌中，S100A2的过表达增加肿瘤侵袭性[12-14]。Cao等应用IHC分析ESCC中S100A2表达，发现S100A2 mRNA、蛋白的阳性表达率分别为77.5%和72.5%，而正常食管黏膜全部表达S100A2蛋白及 mRNA，S100A2表达下调与肿瘤分化和淋巴转移呈负相关[15-16]。相比正常食管黏膜组织，Barrett’s食管癌中S100A2 蛋白表达量明显增高[15-17]。本研究表明，P.gingivalis能够诱导S100A2表达上调，ESCC组织中P.gingivalis丰度与S100A2表达呈正相关，且S100A2表达降低后，抑制了P.gingivalis诱导的ESCC细胞增殖、迁移及侵袭能力增加。

本研究结果表明，中国华北ESCC高发区P.gingivalis是重要的病因学因素之一，S100A2可能是P.gingivalis促进ESCC演进过程中的重要参与分子之一，是ESCC潜在分子治疗靶点。