牙龈卟啉单胞菌促进4NQO诱导C57BL/6鼠食管鳞癌发生

刘其伟，许海军，焦叶林，阮豪杰，陈 攀，谷变利，齐义军，高社干

中国每年新增食管癌患者占全球一半以上，组织学上，食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占所有食管癌的90%以上[1]。由牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)诱发的宿主口腔微生态失衡不仅是慢性牙周炎和牙齿脱落的主要原因之一[2-3]，还与多种肿瘤的发生发展密切相关[4-5]。由于缺乏特异、敏感的早期诊断手段及分子标志物，目前中国确诊的大部分食管癌(Esophageal cancer, EC)患者已发展至中晚期，导致预后极差[6]。近期研究表明口腔关键致病菌P.gingivalis、具核梭杆菌与ESCC分化、肿瘤转移、化疗耐药、预后不良等临床病理特征相关，但其详尽的分子机制并不十分清楚[7-8]。本实验以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide，4NQO)诱导的C57BL/6鼠ESCC模型为基础[9-10]，磨牙丝线结扎和P.gingivalis感染制备慢性牙周炎模型，明确P.gingivalis在ESCC模型鼠食管肿瘤发生过程中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组120只6周龄C57BL/6雄鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司，分为对照组、溶剂对照组、4NQO组和4NQO联合P.gingivalis组等4组，每组各30只。120只鼠进入实验室适应1周后，饮水中抗生素(甲硝唑、新霉素、氨苄青霉素和万古霉素)处理2周，4NQO组和4NQO联合P.gingivalis组饮水中50 μg·mL-14NQO处理8周。8周后对照组、溶剂对照组、4NQO组正常喂养，4NQO联合P.gingivalis组小鼠上颌第二磨牙丝线结扎，P.gingivalis持续感染。实验过程中，于22、26、30、34周等4个时间点分批处死小鼠，每次每组至少6只。

1.2 试剂使用及配制鼠饮水中甲硝唑、新霉素、氨苄青霉素浓度为0.2 g·L-1，万古霉素浓度为0.1 g·L-1。4NQO试剂(Sigma，货号N8141)，丙二醇(阿拉丁，货号P103433)。0.5 g 4NQO粉剂溶于100 mL 1,2-丙二醇，配制溶度为5 mg·mL-1储存液，4 ℃避光保存。小鼠饮水中4NQO终浓度为50 μg·mL-1。

1.3 C57BL/6小鼠牙周炎模型建立20%乌拉坦溶液(Sigma，货号U2500-100G)，按小鼠体质量6 μL·g-1给药，于显微镜下分别对小鼠左右上颌第二磨牙进行丝线结扎。取对数生长期P.gingivalis(OD 600吸光度1-1.7)，2 000 r·min-1离心10 min，2%羧甲基纤维素溶解P.gingivalis，浓度为2×1010·mL-1，取菌液50 μL涂抹于小鼠上颌磨牙区，隔天涂抹，连续涂抹2周后，每周涂抹2次。牙周炎建模完成后，分别于第14、18、24周连续对小鼠口腔进行拭子取样检测P.gingivalis。

1.4 小鼠饲养及样本采集实验过程中鼠房温度为26 ℃，记录小鼠进食、饮水、粪便、毛发以及活动度、精神状态等，于22、26、30、34周对小鼠进行称重、记录。于第22、26、30、34周等4个时间点分别处死小鼠，每组至少6只，处死前对小鼠称重、口腔拭子取样，食管离体后沿纵轴剪开，观察并记录食管黏膜表面病变。实验各组小鼠食管组织一半放置于福尔马林溶液固定后脱水、包埋、切片，HE染色，另一半-80 ℃保存。

1.5 数据处理采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理分析，肿瘤面积采用Adobe Photoshop图像处理软件圈定，依据直尺刻度、按像素换算肿瘤面积大小，肿瘤病变面积比较采用t检测，小鼠体质量变化比较采用方差分析，检验水准为P<0.05。

2 结果

2.1 实验过程中小鼠体质量变化图1显示22、26、30、34周时各组小鼠处死时的体质量，其中对照组和溶剂对照组在各时间点上平均体质量变化不明显，平均约30 g；26周时4NQO组和4NQO联合P.gingivalis组体质量开始下降，随着实验进展，这两组小鼠体质量逐渐降低，34周时降至最低；4组实验鼠中，4NQO联合P.gingivalis组降低尤其显著，体质量最轻，实验结束平均体质量为23.54 g。

图1 22周、26周、30周和34周时各组实验鼠处死时小鼠体质量

2.2 食管黏膜表面动态变化于22周时，4NQO组和4NQO联合P.gingivalis组小鼠食管黏膜上皮粉红色、粗糙、不规则乳头状增生，灶性分布，随着实验进展，上述病变逐渐加重；4NQO联合P.gingivalis组小鼠的病变较4NQO单纯处理组严重，灶性分布的乳头状增生数目最多，实验结束34周时病变最明显。对照组和溶剂对照组小鼠在整个实验过程中，食管黏膜表面光滑、粉红色、黏膜下血管纹理清晰，见图2。

2.3 食管黏膜组织学动态变化食管组织HE染色可见，22、26、30、34周等4个时间点对照组和溶剂对照组上皮完整，基底细胞大小均一、排列整齐，未见明显细胞增生。22周时，4NQO组和4NQO联合P.gingivalis组鼠食管黏膜上皮开始增厚，基底细胞开始出现弥漫性增生；26周时，4NQO联合P.gingivalis组鼠基底细胞出现灶性不典型增生，细胞层次增多，排列紊乱，极性消失，黏膜表面角化层出现灶性缺失，随着实验进展，不典型增生细胞增生为乳头状，突出于黏膜表面，黏膜表面角化层灶性缺失范围增大。4NQO联合P.gingivalis组小鼠的上述各种病变均较4NQO单纯处理组严重。实验36周结束时，4NQO联合P.gingivalis组小鼠可见体积增大的癌细胞、排列不规则、异型性明显，癌变细胞浸润至肌层。

图2 22周、26周、30周和34周时各组实验鼠食管黏膜表面变化

图3 22周、26周、30周和34周时各组实验鼠食管组织学变化(HE, ×100)

2.4 食管黏膜病变面积和发病率实验各组小鼠食管拭子Q-PCR检测P.gingivalis感染及丰度，发现4NQO联合P.gingivalis组内11只鼠，5只P.gingivalis阳性，鼠食管表面生物膜中P.gingivalis平均量为2.04×104。该组内P.gingivalis阳性小鼠食管黏膜病变面积明显大于阴性鼠(图4A)，阳性鼠肉眼见发病率也明显高于P.gingivalis阴性鼠(图4B)；4NQO联合P.gingivalis组中P.gingivalis阳性小鼠食管黏膜病变面积(图4C)和病变发生率(图4D)也显著高于4NQO组鼠。

3 讨论

流行病学研究证实，约15%～20%的肿瘤起源于感染相关的慢性炎症。慢性炎症病灶微环境含有大量的氧自由基、细胞因子和生长因子，刺激局部细胞增殖，诱发细胞基因组不稳定，使正常细胞逐步发生恶性转化。

目前观点认为，人体各组织器官微生物群体，即微生态，是机体罹患疾病的重要原因之一[11]。人体消化道微生态紊乱不仅能够引起口腔局部组织的破坏，还能够调控免疫反应损伤远处组织，诱发多种疾病的发生和进展，如慢性牙周炎、心血管疾病、多种肿瘤[12]。正常食管微生物组由链球菌等革兰氏阳性菌为主的菌群构成，而Barrett’s食管和食管炎组织的微生物组转变为革兰氏阴性菌为主[13]。口腔微生态中有超过700种不同的细菌，ESCC患者口腔唾液中微生物多样性降低，Prevotella、Streptococcus和Porphyromonas属细菌丰度明显增高[14]。另一项前瞻性研究表明，口腔唾液中P.gingivalis高丰度与ESCC患病风险呈正相关[15]。中国食管癌高发区ESCC组织中P.gingivalis丰度明显高于癌旁组织，并且与癌细胞分化、淋巴结转移、TNM分期和ESCC 患者生存期缩短显著正相关[12]。上述研究表明：P.gingivalis可能是 ESCC发生发展的重要致病因素之一。

4NQO诱使DNA形成加合物，导致腺嘌呤和鸟嘌呤碱基替换。通过饮水给予模型鼠不同浓度4NQO，28周后能够成功诱导大鼠和小鼠口腔及食管发生癌变，该模型已成功用于EC化学预防药物的研究。50 μg·mL-14NQO饮水喂饲C57BL/6鼠8周，100%口腔和33%食管黏膜组织发生病变，100 μg·mL-14NQO饮水喂饲16周，100%口腔和食管均发生病变[16]。在此基础上，本实验应用50 μg·mL-14NQO饮水喂饲C57BL/6鼠8周后，磨牙丝线结扎制备慢性牙周炎模型，并给予P.gingivalis口腔局部涂抹，模拟人口腔P.gingivalis慢性持续感染。通过Q-PCR检测食管黏膜生物膜中P.gingivalis感染，发现4NQO联合P.gingivalis组中小鼠P.gingivalis感染率约为45.5%，证实口腔P.gingivalis可经吞咽至食管。22周时，4NQO组和4NQO联合P.gingivalis组鼠食管黏膜病变开始逐步形成，随着P.gingivalis持续作用，病变逐渐加重；36周实验终止时，4NQO联合P.gingivalis组3只小鼠发生癌变。实验过程中各时间点，4NQO联合P.gingivalis组小鼠食管黏膜病变面积和发病率均高于单纯4NQO处理组，表明P.gingivalis能够促进4NQO诱导的食管黏膜增生及癌变。与本实验类似，4NQO(8周)联合P.gingivalis和具核梭杆菌(18周)处理Balb/c雄鼠，发现P.gingivalis和具核梭杆菌显著增加口腔舌黏膜病变严重程度和舌鳞癌发生率，并阐明这两种细菌激活的IL-6/STAT3信号通路参与了舌鳞癌的发生发展过程[17]。

图4 4NQO组和4NQO联合P. gingivalis组内(A、B)及组间(C、D)P. gingivalis阳性和阴性鼠食管黏膜病变面积(A、C)及发病率(B、D)

本研究在4NQO诱导食管黏膜病变的基础上，通过上颌磨牙丝线结扎和P.gingivalis感染制备慢性牙周炎模型，证实P.gingivalis能够促进4NQO诱发的病变进展至癌变，为深入探讨P.gingivalis促进ESCC发生发展分子机制和分子治疗靶点提供了实验动物模型。