长链非编码RNA BCYRN1在非小细胞肺癌中的研究进展

崔文韬 李玉凤 董桂兰 胡万宁

作者单位：063210 唐山 1华北理工大学研究生院；2唐山市人民医院中心实验室；3唐山市人民医院放化疗第五科；4唐山市工人医院

肺癌是全球发病率、死亡率均列首位的恶性肿瘤，2018年我国新发肺癌病例数为73万例，死亡63万例［1-2］。肺癌主要分为两种组织学亚型［3］：非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（smal cell lung caner，SCLC）。其中 NSCLC 占肺癌患者总人数的80%～85%，而SCLC仅占15%［4］。目前尽管肺癌的多种治疗模式，如手术、化疗、分子靶向治疗、免疫治疗等趋于规范，以及基因测序等检测手段的出现，其诊断和治疗取得了长足的进步，但是肺癌患者尤其是晚期患者预后依然较差［5］。因此，阐明肺癌的发生、发展机制，寻找特异性的诊断及治疗靶点尤为重要。近年来，学者发现表观遗传改变是癌症发生、发展的重要因素，DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）等表观遗传因素的改变在肺癌发生发展中发挥重要作用［6-7］。ncRNA是指不编码蛋白质的RNA，在基因表达调控方面具有重要作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一段长度为200～1 000 kp的核苷酸碱基序列，也是ncRNA的重要成员。lncRNA在基因组中极为丰富，目前通过 ENCODE、FANTOM3、GTEx和GENCODE等基因组计划，已预测出60 000多个lncRNA，其中 MALAT1［8］、HOTAIR［9］、脑细胞质 RNA 1（brain cytoplasmic RNA 1，BCYRN1）［10］等多种 lncRNA被证实在肺癌细胞发育、分化和增殖等过程中发挥重要作用。目前研究显示BCYRN1在NSCLC患者的血清、癌组织和NSCLC细胞系中均高表达，且可能通过相应的靶基因发挥促进细胞增殖、侵袭及上皮间质转化作用［10-13］，但是对细胞凋亡的作用各研究报道结果不一［10-11］。而BCYRN1在NSCLC中尚未见报道。本文就BCYRN1与NSCLC发生、发展的研究进展作一综述。

1 BCYRN1概述

BCYRN1是WATSON等于1987年采用引物延伸反应分析法在灵长类动物脑组织中首次发现的一类具有脑组织特异性的lncRNA［14］，是一段长度约为200个的核苷酸碱基序列，因此又称BC200。编码BCYRN1的基因位于人类染色体2p12上，转录位点位于人类2号染色体上的钙调蛋白2和上皮细胞黏附分子的蛋白质编码基因之间［15］。BCYRN1由 RNA聚合酶Ⅲ转录，其有效转录需要TATA盒、A和B盒启动子元件和上游启动子元件，特定的转录因子也可通过与BCYRN1启动子元件结合并影响其转录［16］。BCYRN1的结构包含5′端Alu元件、富含腺苷的中央区域和3′端三个序列域［17］。与许多在细胞核定位并起作用的lncRNA不同，BCYRN1是细胞质RNA，在猴类和人类脑细胞中超过95%的BCYRN1分布于细胞质和细胞膜/细胞器中，仅少量BCYRN1分布于细胞核［15］。

早期关于BCYRN1的功能主要集中于中枢神经系统，认为BCYRN1是一个灵长类动物神经系统特异性的lncRNA，在其他组织低表达甚至不表达［14］。如研究报道，与阿尔茨海默病相关的特定大脑区域中BCYRN1表达水平上调，且随着疾病进展其表达水平进一步升高［18］。但是随着研究的深入，通过RNA印迹分析和原位杂交技术发现BCYRN1在多种癌症包括肺癌、乳腺癌、子宫颈癌、食管癌、卵巢癌、腮腺癌和舌根癌等癌组织中高表达，而在相应癌旁正常组织及一些癌症（如膀胱癌、结肠癌）中则未检测到［19］。

2 BCYRN1在NSCLC中的表达及作用

2.1 BCYRN1与细胞增殖

目前研究显示BCYRN1在NSCLC细胞中主要发挥促进细胞增殖作用。GAO等［10］在肺癌细胞（H1299、SPCA1）中转染si-BCYRN1后，CCK-8法检测结果显示下调BCYRN1可抑制细胞增殖。WANG等［11］亦发现 BCYRN1在肺腺癌细胞（A549、SPCA1）、肺支气管癌细胞系（NCI-H1650）及肺大细胞癌（NCI-H460）中的表达高于正常人上皮细胞系，将siRNA转染至4种细胞系，同样显示敲低BCYRN1抑制了细胞增殖。Wnt/β-catenin信号通路可通过调节关键信号蛋白β-catenin而参与细胞增殖过程，当Wnt信号通路激活时，β-catenin入核，进而促进c-Myc和细胞周期调控蛋白 CDK4和CyclinD1转录［20-21］。WANG等［11］研究发现敲低BCYRN1可抑制细胞增殖，同时导致β-catenin、c-Myc、CDK4和CyclinD1表达水平下调，因此认为BCYRN1可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路而发挥细胞增殖抑制作用。综合可见，BCYRN1在NSCLC细胞中呈高表达，且可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进细胞增殖，发挥促癌作用。

2.2 BCYRN1与细胞凋亡

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/AKT）通路异常激活在肿瘤发生中发挥关键作用［22］。lncRNA可能通过调控PI3K/AKT通路的相关靶点而影响细胞凋亡。有研究报道下调lncRNA SLC25A5-AS1可通过调控miR-19a-3p/PTEN/PI3K/AKT信号通路而抑制胃腺癌细胞凋亡［23］，也有研究显示过表达lncRNA HULC可通过上调鞘氨醇激酶1（SPHK1）抑制肺腺癌细胞（NCIH23、NCI-H522）凋亡，并进一步诱导其下游PI3K/AKT途径激活［24］。而目前关于BCYRN1在NSCLC细胞凋亡中的作用各文献报道结果并不一致。GAO等［10］在肺腺癌NCI-H1299细胞中敲低BCYRN1表达发现可抑制细胞凋亡，且可能通过下调PI3K/AKT信号通路的关键蛋白表达实现；此外还发现敲低BCYRN1可促进耐药肺腺癌细胞H1299/DDP凋亡，但具体作用机制未知。然而，WANG等［11］研究却发现，敲低BCYRN1可能通过抑制Wnt/β-catenin通路关键蛋白的表达促进肺腺癌细胞（A549、SPC-A1）、细支气管肺泡癌细胞（NCI-H1650）和大细胞肺癌细胞（NCI-H460）凋亡。综上推测，在NSCLC中BCYRN1可能作为Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号通路的上游而发挥促进或抑制细胞凋亡作用，其机制有待于进一步研究。

2.3 BCYRN1与上皮-间质转化及侵袭

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺癌发生迁移和侵袭的关键步骤，肺癌细胞经过EMT失去了上皮细胞的特征，更多的分子标志物能够表达，进而促进肺癌转移与侵袭［25］。E-cadherin、N-cadherin及Snail是EMT相关蛋白，其中E-cadherin表达缺失是EMT最重要的标志，Snail等转录因子则对微环境刺激作出响应，并充当EMT程序的分子开关［26］。孟腾等［12］报道肺腺癌和肺鳞癌组织中BCYRN1表达高于癌旁组织，进一步通过免疫组织化学染色法发现E-cadherin表达阴性、N-cadherin及Snail蛋白表达阳性患者的癌组织中BCYRN1高表达，提示BCYRN1可能与NCSLC细胞发生EMT有关。

金属蛋白酶的激活可使细胞外基质和基底膜重塑，而这是癌细胞侵袭转移过程中的关键环节［27］。HU等［13］报道BCYRN1在NSCLC组织中的表达水平高于正常肺组织，RT-PCR检测发现其在肺腺癌细胞（NCI-H1299、SPCA-1）、鳞癌细胞（H520）和腺鳞癌细胞（L78）中c-Myc也呈高表达，提示这些病理类型的细胞中也可能存在c-Myc直接调控BCYRN1表达的方式，但目前尚未见BCYRN1与这些蛋白作用的报道。此外，该研究还发现下调BCYRN1可抑制肺腺癌A549细胞迁移和侵袭，基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）家族的MMP9和MMP13表达下降，因此认为BCYRN1可能通过增强MMP9和MMP13的表达从而促进肺腺癌A549细胞转移。张婧婧等［28］通过双荧光素酶实验检测发现BCYRN1可与miRNA-503的3'-UTR特异性结合，在肺腺癌NCI-H1299细胞中敲低BCYRN1可抑制细胞迁移和侵袭，Western blot检测发现敲低BCYRN1可上调miRNA-503表达，继而降低Notch1及其下游HES1蛋白表达水平，由此认为敲低BCYRN1抑制肺腺癌NCI-H1299细胞迁移和侵袭可能通过调控这些蛋白实现。以上研究说明，NSCLC中高表达的BCYRN1可能通过促进N-cadherin、Snail以及MMP家族的表达或者抑制miRNA-503/Notch1/HSE1信号通路进而促进NCSLC EMT和侵袭，但具体的作用机制尚需进一步明确。

2.4 BCYRN1与能量代谢

肿瘤细胞的一个普遍特点是即使在氧含量正常的情况下，葡萄糖摄取量和乳酸的积累量也会逐渐升高，利用糖酵解作为主要能量代谢的来源，获得更高的糖分解能力，使葡萄糖转变为乳酸而产生腺苷三磷酸（ATP），这种现象称为Warburg效应。近年来，糖酵解在肿瘤中的作用备受关注，也有研究证实糖酵解与NSCLC细胞增殖和转移密切相关［29］。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是一种参与肿瘤糖酵解的关键限速酶，而M2型丙酮酸激酶（PKM2）是丙酮酸激酶的关键同工酶［30］。LANG 等［31］研究发现NSCLC组织中BCYRN1表达水平高于癌旁组织，双荧光素酶实验证实BCYRN1直接靶向miR-149，在肺腺癌H1299细胞中过表达BCYRN1可导致miR-149表达下降，细胞糖酵解能力增强，双荧光素酶实验证实PKM2为miR-149的直接靶基因。该研究为了分析PKM2是否为BCYRN1/miR-149轴下游的编码基因，进一步在肺腺癌H1299细胞中敲低miR-149，结果发现可以逆转由敲低BCYRN1诱导的PKM2蛋白表达水平降低，而敲低PKM2表达则逆转了miR-149抑制剂对葡萄糖消耗和乳酸生产的抑制作用。由此认为，BCYRN1/miR-149/PKM2信号通路与Warburg效应有关，而该通路可能是肺癌潜在治疗靶标。

2.5 BCYRN1与预后

已有研究通过RT-PCR检测证实BCYRN1在肺癌患者血清、组织中高表达［10-13，32］，提示BCYRN1可能是潜在肺癌的生物指标。曾晓等［32］通过RT-PCR检测肺腺癌和肺鳞癌患者血清中BCYRN1的相对表达量，发现其在癌组织中的表达明显高于健康对照组（2.84±0.95 vs 1.16±0.50，P＜0.05），分析 BCYRN1 的表达临床病理特征，发现BCYRN1表达与肿瘤大小、临床分期有关，但是与性别、年龄、组织学分型无关。随访分析发现BCYRN1高表达的患者中位无进展生存时间（15个月vs 21个月）与中位总生存时间（19个月vs 28个月）均低于BCYRN1低表达患者；采用Cox比例风险回归模型分析影响患者预后的因素，结果显示BCYRN1高表达、肿瘤直径＞3 cm和淋巴结转移阳性提示患者预后不良。孟腾等［12］采用RT-PCR分析60例肺腺癌和鳞癌癌（肺腺癌37例、肺鳞癌23例）原发灶及其配对癌旁肺组织标本，发现在TNMⅡ～Ⅳ期肺腺癌和鳞癌组织中BCYRN1表达高于Ⅰ期，且高表达患者临床分期较晚，更易出现淋巴结转移。GAO等［10］检测76例NSCLC癌组织及癌旁组织中BCYRN1的表达情况，亦发现癌组织中BCYRN1的表达高于相应癌旁组织，根据BCYRN1表达水平分为BCYRN1高表达组和BCYRN1低表达组，发现BCYRN1表达与临床分期、淋巴结转移及远处转移相关，而与年龄、性别无关；Kaplan-Meier分析结果显示BCYRN1高表达患者预后较差。综上可见，目前研究认为BCYRN1高表达与患者临床分期、淋巴结转移等不良临床特征有关，检测其表达可能有助于早期诊断及评估预后。但是以上均为回顾性小样本研究，BCYRN1作为诊断及预后标志物还需开展多中心大样本研究证实。

3 小结

随着二代测序技术的快速发展，表观遗传学标志物的变化可能成为肿瘤高风险评估、早期诊断、治疗以及预后的有效标志物［33］。lncRNA在癌症中的作用也将不断被揭示。BCYRN1作为lncRNA的其中一个分子，目前研究发现其在肺癌组织和细胞均中高表达，且与临床特征及预后有关；针对BCYRN1与NSCLC的功能实验发现，BCYRN1可能通过参与调控不同的信号通路或直接靶向下游microRNA等多种机制而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡及EMT，BCYRN1有望成为NSCLC诊断、预后判定及治疗的潜在靶点，但是BCYRN1发挥的作用及确切的作用机制仍需开展更深入的基础研究及大样本多中心临床研究证实。