外泌体在肿瘤和极端条件中的作用和检测

王姝宏 余幼林李凯 林宇晟甘进锋 谢飞凌 李勇 黄思铨张灏

作者单位：510632 广州 1暨南大学医学院肿瘤精准医学与病理研究所；432000 孝感 2武汉科技大学附属孝感医院；9700 AD 格罗宁根 3荷兰格罗宁根大学医学中心血液科；NSW 2217 悉尼 4澳大利亚新南威尔斯大学圣乔治医院肿瘤中心；999077 香港 5香港理工大学医疗及社会科学院

外泌体携带丰富的核酸、蛋白质和脂类物质等成分，可通过运输这些内容物至靶细胞，扮演细胞间信息交换的使者，参与多种生理和病理过程［1-2］。研究表明病理条件下（如肿瘤等），细胞释放外泌体的丰度显著提升，且外泌体内容物组分及含量有所不同，说明外泌体内容物可用于指示疾病状态。更重要的是，大量研究表明肿瘤患者体液（如血液、唾液、尿液、腹水、胸膜积液等）外泌体的内容物组分及含量可如实地反映源细胞的特征和状态［1，3-4］。同时，与循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）和循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）相比，外泌体脂质膜结构对其内容物可起到良好的保护作用，且外泌体分泌量大，携带信息多样化（核酸、蛋白、脂质等），在开发液体活检标志物方面前景广阔，可应用于肿瘤诊断、疗效评价和预后分析等［4-7］。目前外泌体标志物的研究主要集中在肿瘤领域，为早期筛查恶性肿瘤提供了新的手段。相较组织活检外泌体优势为非介入性，可重复性地获得样本，能够减少组织异质性对诊断造成的偏差，同时及时反映疾病发展的动态变化。外泌体在肿瘤免疫等极端环境方面也起重要作用。而靶向外泌体生物过程和以外泌体作为药物载体的治疗也将是肿瘤治疗的新兴手段［1-2］。此外，细胞在肿瘤免疫微环境、低氧、氧化应激和致病因素（烟酒暴露）等多种条件下，也可通过外泌体将其内容物信息递送至其他细胞，从而参与肿瘤免疫、肿瘤转移等病理过程［2］。近年来外泌体相关研究呈爆发式增长，相关技术（如外泌体提取和示踪技术）也取得了长足的发展，但仍然未能满足研究或临床转化的需要。本文对外泌体液体活检、极端条件下外泌体的功能和机制，以及外泌体提取和示踪技术等研究进展及前景进行综述和分析。

1 外泌体检测及示踪

传统的外泌体提取方法，如密度依赖的超离和梯度离心都依赖昂贵的设备且耗时长；过滤法存在外泌体黏附滤器问题；免疫捕获法可能遗漏某些重要的外泌体亚群；而沉降法杂质较多，限制了其临床推广应用。近期开发了更快速、更具有指向性的肠道病毒（enterovirus，EV）提取手段：交流电芯片和微流控芯片。KO等［8］利用微流控技术开发了一种磁性纳米孔分选芯片，基于多种属性进行捕获，如粒子大小、免疫捕获和密度等，这种基于芯片的技术可以实现快速分离提纯并已用于分离特定癌症分泌的外泌体。LEWIS等［9］设计了一种交流电芯片，可在30 min内从全血中捕获外泌体并进行原位免疫荧光分析。这些技术使外泌体的提取和分析与临床诊断通道实现无缝衔接，对其临床应用至关重要。

在外泌体检测及示踪技术方面，传统的手段存在诸多局限性，包括灵敏度低、耗时长、样品需求量大，难以实现实时监测、大批量检测等［10］。BETZER等［11］利用葡萄糖图层金纳米粒子（GNP）标记外泌体，发现经鼻给药的标记外泌体在脑部大量积聚，体现出这种外泌体标记技术作为脑部疾病诊断及治疗工具的潜力。VERWEIJ等［12］利用绿色荧光蛋白（GFP）衍生物pHluorin标记CD63，对外泌体进行体内示踪，揭示了内源性外泌体的分泌、扩散和被靶细胞摄取的过程。总之，外泌体示踪技术的发展将为外泌体的体内活动可视化提供基础，促进外泌体机制的研究和药物载体的开发。

2 外泌体与肿瘤免疫

2.1 肿瘤来源外泌体的抗肿瘤作用

外泌体可参与机体免疫调节，如肿瘤来源外泌体（tumor-derived exosomes，TEXs）可携带多种分子（肿瘤相关抗原、共刺激分子及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子）刺激免疫细胞产生抗肿瘤免疫反应［13］。外泌体也参与转运机体固有免疫细胞间抗原成分、杀伤性蛋白分子和炎症因子等免疫相关物质，活化免疫效应细胞并增强其细胞免疫反应，调节固有免疫。机体自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）分泌的外泌体含有Fas配体及穿孔素分子等杀伤性蛋白，发挥强大的抗肿瘤细胞毒作用，从而维持机体免疫监视及稳态［14］。同时TEXs携带的核酸成分能激活树突状细胞中TLR3、cGAS-STING等，同样发挥了抗肿瘤免疫应答［15-16］。抗原提呈细胞分泌的外泌体携带T淋巴细胞共刺激分子及MHCⅠ类和Ⅱ类分子，可在不依赖于抗原提呈细胞的情况下直接激活CD8+T淋巴细胞，诱导机体产生适应性免疫应答［15-17］。而白血病细胞分泌的外泌体作用于树突状细胞可以有效促进CD4+T细胞增殖，以及辅助T细胞对细胞因子的分泌，激活细胞毒性T细胞，诱导特异性抗肿瘤免疫应答［18］。

2.2 肿瘤来源外泌体抑制抗肿瘤免疫反应

TEXs可以降低树突状细胞的分化和成熟，减少NK细胞活化受体的表达，抑制T细胞增殖、活化，促进细胞凋亡。TEXs也可促进骨髓源性免疫抑制细胞（MDSC）、调节性T细胞（Treg）、调节性B细胞（Breg）分化和增殖，导致免疫抑制。有研究报道卵巢癌等肿瘤细胞分泌的外泌体可通过携带免疫抑制分子而下调抗原提呈细胞的抗原提呈能力［19］，诱导外周血淋巴细胞和树突状细胞凋亡［20］，从而抑制机体的抗肿瘤免疫应答。在乳腺癌细胞研究中发现其外泌体表面表达细胞因子TGF-β、IL-10和前列腺素E2，可显著抑制T细胞增殖［21］。也有研究报道，TEXs携带的PD-L1可通过与PD-1结合，从而抑制CD8+T细胞增殖［22］。而CD4+T细胞增殖和分化也可被TEXs抑制［23］。GOBBO等［24］研究显示，TEXs可诱导骨髓前体细胞分化为MDSCs，其携带的多种热休克蛋白能激活MDSCs，从而增强MDSC的免疫抑制功能。在食管癌中，TEXs可通过诱导初始B细胞分化为表达TGF-β的调节性B细胞，从而抑制CD8+T细胞活化［25］。

巨噬细胞具有高度可塑性，TEXs可改变其极化类型，包括M1型和M2型。M1型可分泌促炎性细胞因子和趋化因子，参与抗原呈递和抗肿瘤免疫反应；M2型则分泌抑制性细胞因子，具有促癌功能，而肿瘤相关巨噬细胞即属于M2型［26］。在胰腺癌中，TEXs可诱导巨噬细胞向M2分化，并促进胰腺癌转移［27］。也有研究发现，肝脏Kupffer细胞摄取胰腺癌细胞分泌的外泌体后可分泌TGF-β，从而募集更多的骨髓源性巨噬细胞，诱导肝脏形成转移前微环境，增加肝脏转移性负担［28］。在肿瘤转移前微环境形成的过程中，肺脏上皮细胞TLR3也可通过识别肿瘤细胞来源的外泌体携带的RNA分子，上调多个趋化因子，募集中性粒细胞到达肺脏部位，从而促进肿瘤细胞肺转移［29］。此外，肿瘤细胞也可通过外泌体调节肿瘤微环境，抑制抗肿瘤免疫应答。肿瘤外泌体可传递自身的瘤源性受体、蛋白质及RNA给受体细胞而塑造肿瘤生长的微环境，其表面表达免疫抑制分子，可负性调节免疫应答。在黑色素瘤外泌体研究中观察到外泌体可诱导骨髓干细胞向促进肿瘤转移的表型分化［30］。总之，肿瘤源性外泌体发挥抑制肿瘤特异性的免疫应答［31-32］。

2.3 肿瘤来源外泌体与肿瘤免疫治疗

免疫治疗在临床肿瘤治疗上展现了良好的应用价值，目前研究认为TEXs也参与了肿瘤免疫治疗。研究发现，人类黑色素瘤细胞的外泌体携带PD-L1，而外泌体PD-L1可直接与T细胞结合抑制其功能，因此可通过测量治疗前的PD-L1水平预测患者的肿瘤负荷程度及治疗的有效性［22］。但是不同患者、不同肿瘤类型对免疫治疗的敏感性存在差异。目前临床上只有10%～30%的患者对PD-L1/PD-1抗体治疗有效，部分原因可能是细胞外的PD-L1可通过抑制局部或全身免疫反应促进肿瘤进展，因此阻断肿瘤细胞分泌携带PD-L1的外泌体可以提高抗肿瘤免疫反应而延长生存期。外泌体PD-L1也可在引流淋巴结处抑制T细胞功能，从而导致PD-L1抗体治疗的耐受性［33］。可见，肿瘤的免疫逃逸不仅与细胞膜PD-L1相关，还可能与外泌体PD-L1相关。因此，阻断外泌体PD-L1与PD-1结合可发挥免疫治疗作用。PD-L1表达水平在部分肿瘤如黑色素瘤，可作为预测免疫治疗疗效的生物标志物；连续监测外周血中可溶性PD-L1和外泌体PD-L1的变化有助于指导患者的免疫治疗。此外，游离PD-L1可能与PD-L1抑制剂原发耐药相关。因此，联合使用抑制外泌体释放的小分子药物和免疫检查点抑制剂是提高疗效的潜在有效手段［34］。

综上，肿瘤外泌体具有激活或抑制免疫的双重作用，且参与免疫治疗，其具体的主导作用可能与肿瘤类型、肿瘤分期、外泌体种类及内容物有关。因此认为，在时空上对外泌体进行更细致的分类研究，将有助于阐明特定条件下外泌体在肿瘤免疫中的真正作用。

3 极端条件下的外泌体

3.1 微酸环境

肿瘤等疾病中的酸性微环境可改变外泌体的形成与释放。以黑色素瘤为例，微酸不仅能增加肿瘤细胞外泌体释放，还能增加外泌体中脂质体的修饰，且针对性地抑制酸度后，外泌体的释放量显著降低，此外肿瘤酸性环境所导致的外泌体释放增加也可能是肿瘤逃避免疫系统的一种适应机制［35］。最近也有研究报道肿瘤患者中的外泌体数量显著高于非肿瘤患者，尤其在黑色素瘤和前列腺癌中，3种不同的捕获方法均证实肿瘤患者的外泌体含量显著升高，体外实验也证明外泌体分泌的增加依赖酸性环境［36］。以上研究结果为阐明肿瘤进展机制提供了新的理论，也提示靶向肿瘤酸性环境或靶向肿瘤外泌体的释放可能是肿瘤治疗的新策略。

3.2 乏氧环境

乏氧是肿瘤环境的主要特征之一，大量研究表明低氧可促进外泌体的释放和肿瘤血管生成，从而促进肿瘤细胞侵袭、迁移并改变肿瘤的免疫环境［37-38］。乏氧诱导外泌体的分泌增加及其对肿瘤进展的作用日益受关注，但是仍需更进一步研究，以更好地了解缺氧条件下外泌体产生和释放的机制，实现靶向外泌体治疗手段的开发。

3.3 氧化应激

研究表明，氧化应激可以促进肥大细胞释放外泌体，从而向暴露于氧化应激下的受体细胞传递保护信号，进而减少细胞死亡［39］。有研究［40］将 Jurkat和Raji细胞系作为研究T细胞和B细胞白血病/淋巴瘤中NKG2D受体-配体系统的模型，发现热应激和氧化应激可显著增加Jurkat和Raji白血病/淋巴瘤细胞的外泌体分泌。而外泌体携带NKG2D配体，可导致体外NKG2D受体介导的细胞毒性下调，从而损害NK细胞功能。这一结果可部分解释白血病/淋巴瘤患者临床观察到的NK细胞功能障碍。因此，设计细胞抑制和高温抗癌疗法时，应考虑热和氧化应激引起的免疫抑制性外泌体释放。

3.4 烟酒暴露

在多种肿瘤中，吸烟和饮酒被认为是肿瘤发生的危险因素。近期研究也发现吸烟和饮酒可对外泌体的形成与分泌产生影响。如酒精的暴露可影响小鼠小胶质细胞的活力、凋亡和细胞周期，还可影响与细胞膜转运、囊泡形成和分泌相关蛋白Rab的分布，从而影响外泌体的生物形成，并促进热休克蛋白组装至外泌体中［41］。BABUTA 等［42］研究报道，溶酶体功能在慢性酒精性肝病中有缺陷，可导致自噬破坏和外泌体分泌增加。另外，也有研究发现暴露于香烟烟雾提取物可以促进气道上皮细胞分泌外泌体，后者可通过抑制成纤维细胞自噬导致组织重塑［43］。此外，还有研究发现，香烟烟雾提取物不仅可诱导呼吸道上皮细胞外泌体的产生，还可通过其引起的机体氧化应激反应产生氧化产物，如丙烯醛而促进EVs释放［44］。由此认为，吸烟饮酒导致的外泌体变化可能是促进肿瘤发展的重要机制之一。

综上，不同的应激和极端条件可影响外泌体的形成和释放。外泌体通过传递各种信号分子参与调节多种信号通路，影响细胞间的信息交流作用，调控受体细胞活性，从而参与不同极端条件对疾病的调节作用。这些研究结果也提示，不同刺激和极端条件诱导释放的外泌体所携带的内容物改变，与相关疾病过程密切相关，具有作为特异性指示疾病发生和进展标志物以及治疗靶标的潜力。

4 小结与展望

获得用于检测外泌体生物标志物的肿瘤组织样本是实现个性化精准医学的重要环节。然而，侵入性手术存在组织数量有限，获得的组织质量不合格，由于肿瘤位置难以进行活检以及手术和患者管理成本高等问题。因此，开发循环外泌体生物标志物，特别是用于肿瘤诊断的外泌体RNA，成为一个新的方向。目前研究显示外泌体RNA在癌细胞通讯中具有重要作用，可促进肿瘤细胞生长，甚至转移到远处器官，在非侵入性肿瘤诊断以及预后和治疗疗效预测中具有巨大潜力。然而外泌体标志物的研究仍存在许多问题亟待解决：一方面，目前虽然外泌体的分离方法丰富多样，但是均难以将外泌体与其他细胞外囊泡亚群彻底分离；另一方面，虽然外泌体有丰富的内涵物，但丰度普遍偏低，致使外泌体标志物的诊断效率与实际临床应用存在较大差异。因此，标准化的提取和分析技术以及组学的、图谱式的标志物概念是外泌体转化应用到临床的关键。未来需进一步探索其检测方法包括提取方案和分子诊断平台的标准化甚至自动化，以实现分批测定及各研究结果的可比性。此外，未来还需对外泌体在时空上进行更加细致的分类研究，找到高效、简捷的提取方法，开发特异性干预外泌体生物过程的技术手段，才能更好地推动外泌体向临床应用转化。