循环肿瘤细胞临床应用的研究进展

傅潇 姚煜

作者单位：710061 西安 西安交通大学第一附属医院肿瘤内科

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是指在肿瘤形成和发展过程中，从实体肿瘤病变脱落并进入血流循环的肿瘤细胞［1］。CTC是肿瘤发生发展的直接证据，真实反映了肿瘤负荷和特征，并可以提示疗效及预后。既往研究认为CTC的出现即提示肿瘤转移的发生，然而近期研究在早期肿瘤患者外周血中也发现了CTC的存在，因此CTC也可用于早期诊断。此外，与循环肿瘤DNA/RNA和肿瘤细胞来源外泌体相比，CTC还可进行RNA和蛋白组学的表达谱分析、体外细胞形态和功能研究以及信号共定位展示等，为个体化治疗提供了坚实基础。虽然CTC检测具有方便、快捷、无创和可重复采样等优势，但是外周血中CTC数量非常少（转移性乳腺癌中每106～108个有核细胞仅有1个CTC），通常需要富集之后再进行检测或分析。以往因受限于提取和富集技术，CTC并未得到进一步研究和应用。直至近十几年，基于CTC物理特性和分子生物学特征的分离、提取和富集技术的发展，CTC才被应用于临床，并获批为肿瘤标志物，在肿瘤的早期诊断及疗效和预后评估中凸显优势，现就CTC的发展历史、提取技术及临床应用研究进展进行阐述。

1 CTC发展概况

1869年Thomas Ashworht首次报道了CTCs的存在［2］。之后Stephen Paget等提出了“种子与土壤”假说，认为肿瘤转移的机制是癌细胞通过血液和淋巴扩散至身体不同地方，从而诱导周围正常细胞形成“肿瘤微环境”［3］。1998年，CTC首次从血液中分离，并被证实与病理分期相关［4］。此后，CTC才被应用于临床。发表在N Engl J Med的一项前瞻性研究结果提示CTC数目是预测转移性乳腺癌无进展生存期（progression free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）的独立预后因子［5］。自此CTC被认为是肿瘤转移的“前兆”，即CTC是肿瘤转移病灶（血行转移）形成的“种子”细胞，部分细胞可在循环中存活，并在远端器官与新的微环境相互作用下形成转移灶。因此2007年，CTC被美国临床肿瘤学会（ASCO）纳为肿瘤标志物。然而，2010年发表在J Clin Invest的研究表明，肿瘤早期也发现CTC的存在［6］。基于此，2012年病理学年鉴不再认为血液中发现CTC仅提示肿瘤转移的“前兆”。目前随着高通量测序技术和单细胞测序技术的出现，CTC全外显子测序和单细胞测序将有助于更进一步揭示肿瘤异质性和肿瘤演进过程。

2 CTC分离、富集和检测技术

CTC的应用与分离技术发展密切相关。第一代CTC分离技术主要依靠CTC物理特征，如基于细胞大小和密度法是通过膜过滤、密度梯度离心等方法进行分离。这一类方法不依赖CTC抗原表达情况，操作方便，但因CTC变形性以及密度差异易导致漏检，影响分离效果。第二代分离技术是基于CTC表面抗原的表达，利用免疫磁珠进行分选。从本质上讲，这种方法可以分为两大类：基于特定抗原的表达捕获CTC细胞的阳性选择和耗尽给定样品中非CTC的所有细胞的阴性选择。目前唯一获得FDA批准的Cell Search系统［7］就是利用表面抗原的表达进行CTC分选。但该方法受上皮标志物表达影响。到目前为止，仍未有公认和普适性的肿瘤表面抗原标志物，原因有以下几方面：⑴并非所有肿瘤细胞均表达上皮标志物，例如黑色素瘤并不表达上皮标志物。⑵肿瘤细胞入血时会发生上皮－间质转化（epithelial-mesenchymal translation，EMT），下调上皮标志物表达量，导致磁珠对CTC的吸附能力下降，影响检出率。⑶在正常情况下，有极少量的正常上皮细胞脱落入血，或者肿瘤患者在进行手术或其他创伤性治疗后，上皮细胞可进入血液，导致假阳性的出现。第三代分离技术是利用芯片，包括CTC芯片和微流控芯片等对CTC进行分离、富集。该技术并不是一种独立的分离技术，而是优化各类技术的一种手段。该技术分离原理多样，包括基于肿瘤细胞大小、流体力学特性、表面分子标记以及去除白细胞进行阴性富集等［8］。第一代芯片以CTC-Chip为代表，包括Captura公司的GEDI-Chip和Biocept公司的OncoCEE微流微柱富集，主要是利用CTC与血细胞生化特性的差异，在芯片中设置微柱阵列将CTC从血液中分离出来。然而，微柱设计比较复杂，难以进行高通量生产。第二类芯片是以HB-Chip为代表，包括GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的Modular Sinusoidal Microsystem微流表面富集，此类芯片使用抗体包被捕获CTC，能更高效地捕获CTC，捕获效率约为90%，更适合大规模生产。但是，这类芯片所捕获的CTC被固定在抗体包被的装置表面，难以进一步分离。虽然胰蛋白酶能将CTC从装置表面消化并释放，但是经胰蛋白酶消化释放的CTC可能失去很多有意义的表面受体。第三代芯片以CTC-iChip为代表，包括Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的Liquid Biopsy和Fluxion公司的Isoflux微流免疫磁珠富集，这类芯片将免疫磁珠和微流控富集技术相结合，捕获效率与第二代芯片相当。以上芯片均基于CTC化学特性或表面生物标志物进行分离，目前也有基于CTC物理特性进行分选的分离技术，包括基于细胞大小和变形性差异的芯片技术，基于细胞力学性质的芯片技术和基于细胞介电性质的双向电泳技术等。

CTC检测主要包括从蛋白、染色体、DNA和RNA水平实现对肿瘤细胞的定性工作。在蛋白水平，利用免疫荧光标记，如选用CD45-/CK+/DAPI+作为肿瘤细胞定性的标志物，EPISPOT方法可以区分凋亡和有活性的CTC。细胞骨架蛋白对上皮细胞具有特异性，因此细胞角蛋白家族成员（CK8、CK18和CK19）也成为检测上皮表型CTC的标志物［9］。鉴于上皮标志物的局限性，针对干细胞标志物（CD133），间充质标志物（波形蛋白）和肿瘤组织特异性抗原，例如前列腺特异性抗原（PSA）、乳腺特异性抗原乳珠蛋白等也被用于CTC检测。在染色体水平，荧光原位杂交技术能检测特定染色体的扩增情况和靶基因的扩增情况；在DNA水平，基因测序和ARMS可以检测到丰度低至0.1%～1.0%的突变基因；在RNA水平，基因表达图谱和qPCR技术可检测CTC基因表达水平。

3 CTC对肿瘤早期诊断的作用

传统的影像学检查难以发现肿瘤早期病灶。当病灶＜1 cm时，CTC检测有可能早于影像学或临床表现发现肿瘤，从而实现早期诊断。法国巴斯德医院一项研究纳入了168例慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者、42 例吸烟者和35名健康人，研究发现168例COPD患者中CTC阳性的5例患者在随访的5年内均被诊断为肺癌［10］。基于此项研究结果，LEROY等［11］在法国21个研究中心开展了一项前瞻性、非随机、多中心、双盲AIR研究（NCT02500693），以期在肺癌高危人群（吸烟者、COPD患者等）中探讨CTC对肺癌发生的预测作用。近年研究还发现具有特定核型或分子标记的CTC在肿瘤早期诊断中发挥了重要作用。一项纳入136例新诊断的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者、142 例肺部良性疾病患者和32名健康受试者的临床研究，通过阴性富集技术和FISH技术检测8号染色体扩增型CTC，发现CTC数量能较好地区分NSCLC及肺部良性疾病患者［12］。CTC中8号染色体的计数和非整倍性还在鼻咽癌早期诊断中有一定临床意义［13］。近期的一项研究在低剂量CT提示肺部结节的患者中，以组织活检结果作为对照，通过检测10q22.3/CEP10和3p22.1/3q29 FISH探针标记的CTC，与组织活检相比，10q22.3/CEP10和3p22.1/3q29标记的CTC诊断肺癌的准确性为94.2%，敏感性为89.0%，特异性为100.0%［14］。在乙肝相关肝细胞癌中，干细胞样CTC对早期肝细胞癌诊断具有较高的敏感性（82.1%）和特异性（94.2%），并且能区分肝癌、乙肝和肝硬化［15］。此外，CTC与其他肿瘤标志物联合也有助于提高肿瘤早期诊断的准确性。一项纳入155例前列腺癌患者的研究发现，PSA、CTC和12基因检测平台结合后，诊断的准确性达92.7%，CTC还与更高的Gleason评分和高风险相关［16］。CTC与包含CCNE2、DKFZp762E1312、EMP2、MAL2、PPIC和SLC6A8的6基因检测平台相结合也有助于女性生殖系统肿瘤的早期诊断，联合诊断宫颈癌的准确率达44%，对子宫内膜癌诊断准确率达64%，对卵巢癌诊断准确率为19%［17］。

虽然CTC最早被认为是肿瘤转移的早期分子标志，但是随着CTC在早期肿瘤患者外周血中的发现，越来越多的研究提示CTC不仅对早期肿瘤诊断具有重要的作用，而且与肿瘤分级和TNM分期也具有相关性。

4 CTC在肿瘤疗效和预后评估中的作用

CTC已被认为是一个可靠的预后指标，无论在手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗过程中都显示出了良好的疗效和预后评估价值。

在手术治疗方面，LI等［18］在可手术切除的NSCLC患者中发现，术前外周血和静脉血CTC计数是治疗失败时间（time to failure of strategy，TFS）和OS的独立危险因素，而术中首先离断流出静脉可减少肿瘤细胞的播散，改善NSCLC患者的生存结局［19］。也有研究证实术前肺静脉CTC阳性预示更高的疾病复发风险［20］。一项纳入 200例胰腺癌患者的前瞻性CLUSTER研究提示，无论是否接受新辅助化疗，术前CTC计数与胰腺癌术后复发显著相关［21］。因此，术前CTC检测不仅可预测无疾病生存期，也为手术方式和术后治疗方案的选择提供依据。

在化疗方面，有研究报道晚期NSCLC患者化疗后CTC数量下降与更长的PFS显著相关，而治疗前高CTC计数与更差的病理分期和更高转移率相关［22-23］。在乳腺癌中，新辅助治疗前CTC阳性被认为是独立预后因素，结合pCR有助于识别需治疗干预的乳腺癌患者［24］。SPARANO 等［25］在Ⅱ～Ⅲ期 HER2阴性接受术后辅助治疗的乳腺癌患者研究中也发现，CTC与临床复发率呈正相关。一项纳入了430例接受化疗的转移性结直肠癌的前瞻性、多中心临床研究也证实，治疗前和治疗过程中的CTC数量是转移性结直肠癌患者PFS和OS的独立预测因素［26］。动态监测CTC数量变化对疗效评估和预测预后具有重要作用。除CTC数量外，在转移性前列腺癌中，CTC中不同雄激素受体（AR）剪切体也被证实与卡巴他赛疗效相关［27］。

在放疗方面，迄今最大规模的综合了来自美国国家癌症数据库的1 697例和Ⅲ期SUCCESS研究的1 516例早期乳腺癌患者的研究发现，放疗显著延长了CTC阳性患者的局部无复发生存期（local recurrencefree survival，LRFS）和OS［28］。Ⅲ期随机 CONVERT 研究（NCT00433563）则证实了CTC数量预测接受放疗局限期小细胞肺癌的疗效［29］。PREDICT-HN研究（NCT03491176）提示，在头颈部肿瘤中，CTC联合MRI能更好评估放疗疗效，并为后续放疗剂量选择提供依据。在局部晚期直肠癌中，CTC数量变化和CTC中胸苷酸合酶（TYMS）和切除修复蛋白RAD23同系物B（RAD23B）表达变化与接受新辅助同步放化疗后的pCR相关，检测CTC数量和TYMS、RAD23B表达的变化能够预测局部晚期直肠癌患者对新辅助放化疗疗效，为下一步治疗提供决策［30］。由此可见，CTC不仅能够预测放疗疗效，还可能为优化放疗人群和放射剂量提供依据。

在靶向治疗方面，表达特定靶点CTC的变化能够预测靶向治疗疗效。在41例接受培美曲塞联合厄洛替尼的EGFR突变晚期NSCLC患者中，78%的患者在治疗基线的外周血中检测到CTC，且高水平CTC与不良预后相关；治疗过程中，CTC水平下降与疗效呈正相关［31］。JIANG 等［32］在 232例一线接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变晚期NSCLC患者中证实，叶酸受体阳性CTC计数可用于动态监测和预测EGFR-TKIs疗效和患者预后。PAILLER等［33］通过FISH技术检测18例ALK阳性的NSCLC患者CTC中的ALK重排情况，发现CTC与组织ALK重排具有较高的一致性，认为CTC可作为ALK阳性NSCLC的补充诊断，同时监测ALK抑制剂疗效。新近研究还发现CTC可用于探索ALK抑制剂的耐药机制［34］。CTC不仅代表了肿瘤细胞的生物学和基因组学特性，而且反映了肿瘤的异质性。在纳入19例ER+/HER2-乳腺癌患者的研究中发现，84%的患者在治疗过程中获得了表达HER2的CTC，随后的功能学实验发现，HER2+CTC增殖能力更强，且不依赖HER2通路；而HER2-CTC中Notch通路和DNA损伤通路被激活［35］。之后也有研究报道HER2+CTC的转移性HER2阴性乳腺癌患者能从HER2靶向治疗中获益［36］。

在近年来兴起的免疫治疗中，发现CTC数量和CTC表面PD-L1表达的动态变化与Nivolumab疗效相关［37］。然而，也有研究报道在接受Nivolumab治疗的Ⅳ期NSCLC中未发现治疗前PD-L1+CTC与预后有相关性，但对Nivolumab原发耐药的患者治疗基线时具有更高的 PD-L1+CTC数（≥1%）［38］。在头颈鳞癌中，PD-L1+CTC 提示更短的 PFS和OS［39］。在肝癌、胃癌和胃食管结合部癌中，检测CTC表面PD-L1的表达也可用于预测PD-1抑制剂SHR-1210的疗效［40］。与肿瘤组织中PD-L1表达情况相似，CTC中PD-L1表达与免疫检查点抑制剂疗效的关系也仍需进一步探索。除PD-L1外，CTC中MART-1、MAGE-A3和PAX3表达也被证实与免疫治疗疗效相关［41］。此外，CTC与免疫细胞活性、血小板等肿瘤微环境检测相结合，能共同分析肿瘤复发转移风险，有利于更全面评估预后［42］。

除CTC数量外，CTC簇、CTC染色体改变、基因突变和基因表达、细胞分型等也被证实与肿瘤疗效和预后相关。CTC簇被认为是乳腺癌转移的寡克隆前体［43］，且能通过改变DNA甲基化，促进乳腺癌转移［44］。CARTER 等［45］探讨了 CTC 拷贝数畸变在预测小细胞肺癌化疗耐药中的作用，发现CTC拷贝数畸变区分化疗敏感组或耐药组的准确率达83.3%，且两组患者的PFS差异有统计学意义。在结直肠癌CTC中，鸟苷酸交换因子表达升高与较短的PFS呈正相关［46］。在胰腺癌中，不同CTC细胞分型也与预后相关：上皮型CTC的存在与不良预后相关，可作为独立的预后预测因子，同时上皮型、间质混合型CTC与复发密切相关［47］。在多发性骨髓瘤中，二代测序结果表明CTC和对应的骨髓细胞中的基因表达具有高度一致性，CTC中CD44的表达与肿瘤转移相关［48］。不仅如此，在乳腺癌中，全基因组测序结果提示CTC中信号量4D与乳腺癌脑转移发生相关［49］。因此，根据CTC染色体和基因突变以及表达情况对CTC进行分型，确定具有特殊临床意义（如耐药、转移、复发等）的CTC亚型，能够为后续CTC单细胞研究提供更明确的指导意义。

5 小结

CTC可作为分析患者肿瘤生物学特征的样本，目前研究认为CTC有助于及时发现肿瘤的生物学变化，并为及时调整治疗方案提供参考，从而实现实时、个体化治疗，是目前具有发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，CTC对发现疾病变化更敏感，能更科学、迅速地评价疗效。2019年NCCN乳腺癌指南已引入cM0（i+）分期，确认CTC在肿瘤分期系统中的重要意义。我国也发表了《循环肿瘤细胞在结直肠癌中的应用专家共识》，明确了CTC在动态评估结直肠癌患者疾病状态、早期筛查、预后评估及治疗反应监测中的重要作用。同时得益于分子生物学和生物信息学的发展，CTC的研究和应用将不仅仅局限于疾病筛查、诊断、疗效和预后评估，CTC细胞生物学、分子生物学和基因组学的特征已受到了越来越多的关注。此外，还有研究将CTC进行改造，使其表达TGF-β；或将CTC作为药物运输载体，靶向杀伤肿瘤细胞，且发现改造后或携带药物的CTC具有抑制肿瘤效应，但是这些研究仍在临床前阶段，需要更进一步探索。