环状RNA在肿瘤表观遗传学中的机遇及挑战

傅俊江 肖婷

作者单位：646000 泸州 西南医科大学医学基础研究中心；表观遗传与肿瘤四川省高校重点实验室

表观遗传是指在不改变DNA序列的前提下通过化学修饰调控基因表达的一种遗传方式，表观遗传修饰异常见于包括肿瘤等人类的多种疾病并可影响其发生发展，常见的表观遗传修饰方式包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。环状RNA（circular RNA，circRNA）是非编码RNA家族成员，是在哺乳动物细胞内发现的一组特殊的长短不一的非编码RNA，通过非经典剪接方式进行反向剪接形成。目前研究发现，circRNA能充当miRNA海绵，结合RNA相关蛋白和转录后调控等，参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭转移等多种病理生理的调控［1-3］。同时circRNA具有内源性、丰富、保守、稳定等特点［1］，且既可在癌症组织中特异表达，也存在于唾液和外泌体中［4］，因此检测circRNA相关标志物有望为临床肿瘤诊断、预后和治疗提供无创检测的手段。本文主要阐述circRNA相关标志物在肿瘤中的研究进展及应用现状，并探讨其在肿瘤表观遗传学中的机遇和挑战。

1 circRNA与胃癌

目前胃癌尚缺乏特异的早期诊断生物标志物，就诊时大多患者往往错过最佳治疗时期，致使预后较差。因此众多学者致力于寻找早期诊断和治疗靶点，其中circRNA因其独特的生物特征受到关注，已有大量研究证明，circRNA在胃癌的早期诊断、预后判断、治疗靶点筛选等方面发挥着重要作用，具有较高的临床转化价值。

circRNA可特异性存在于癌组织，目前大量研究对胃癌组织及血浆中的circRNA进行研究。GAO等［5］在胃癌组织和血浆中检测发现hsa_circ_0000190表达下调，且较胃癌经典的生物标志物（CEA和CA19-9）具有更好的敏感性和特异性。LI等［6］对101例胃癌组织与邻近非肿瘤组织及36例术前、术后患者的血浆标本进行配对研究，亦发现hsa_circ_002059在胃癌组织和血浆中均显著下调，ROC曲线下面积（AUC）为0.73，敏感性为0.81，特异性为0.62；同时与胃癌远处转移、淋巴结转移、远端转移等呈负相关。此外，circRNA凭借独特的生物学性质在胃液诊断中也凸显优势，例如研究发现hsa_circ_0014717存在于胃癌组织和胃液中，且表达下调，与肿瘤分期及远端转移有关［7］。而circPVRL3在胃癌组织及细胞系中表达下调，也与较高的TNM分期和较低的整体生存率有关［8］。因此认为，这些circRNA可能成为新的、稳定的胃癌早期诊断和预后分子标志物。

在胃癌中circRNA还可作为miRNA的海绵起调控作用，有效抑制和逆转胃癌增殖、侵袭和转移以及耐药性等恶性生物学行为，在胃癌治疗中同样表现出巨大的潜力。研究发现circ-PVT1可充当miR-125家族成员的海绵而促进胃癌细胞增殖和侵袭，在胃癌组织中circ-PVT1随其基因组位点的扩增而上调，而沉默circ-PVT1则能抑制肿瘤细胞增殖［9］。circ-PVT1还可通过海绵化miR-124-3p而调控ZEB1的表达，进而促使胃癌细胞对紫杉醇耐药［10］。认为circ-PVT1有望作为胃癌预后和治疗的潜在分子标志物或治疗靶点。ZHANG等［11］研究亦发现hsa_circ_100269可通过靶向miR-630抑制胃癌细胞生长。而hsa_circ_104916表达不仅与胃癌分期、淋巴结转移和侵袭程度相关，在体外异位表达hsa_circ_104916还能有效抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，而这可能通过抑制 EMT过程实现［12］，可见 hsa_circ_100269和hsa_circ_104916在胃癌中可能作为抑制因子发挥作用。此外，近年来hsa_circ_0014717、circCCDC66、hsa_circ_0010882、hsa_circ_0000467、circRHOBTB3和hsa_circ_00001649等circRNA相关标志物也陆续被发现可能成为胃癌肿瘤标志物［13-17］。

2 circRNA与肝癌

越来越多的研究表明，circRNA表达的改变对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的生物学特性有广泛影响，存在于HCC组织中的circRNA与邻近非癌组织相比差异性明显，在细胞系中circRNA也与细胞增殖、侵袭和转移等密切相关，可作为HCC早期诊断、预后的标志物以及潜在的治疗靶点。研究发现circRNA ciRS-7［18-19］在HCC癌组织中的表达水平低于非癌组织，过表达ciRS-7还可促进HCC细胞增殖和侵袭，而敲除则细胞增殖和侵袭受抑制。以往研究报道 ciRS-7对miR-7具有“超级海绵”功能［1］，以上研究也发现HCC中ciRS-7可作为miR-7的内源竞争RNA（ceRNA）竞争性地抑制miR-7活性，从而促进HCC发生发展。此外，ciRS-7高表达还与肝微血管侵袭（microvascular invasion，MVI）和甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平有关，可作为肝MVI新的生物标志物［18］。hsa_circ_0001649［20］则与 ciRS-7 相反，在 HCC组织中表达下调。hsa_circ_0001649还与肿瘤大小和转移呈负相关，可作为HCC预后不良因子，通过序列中蛋白结合位点与RBP相结合，从而调节HCC生长与增殖，还可通过多个miRNA海绵功能抑制肝癌进展［21-22］。

HCC 癌组织中 hsa_circ_0005075［23-24］、circHIPK3［25］和circ_0016788［26-27］等circRNA则表达上调。其中上调的hsa_circ_0005075与肿瘤大小和转移呈正相关，且可能通过抑制miR-335和miR-431促进HCC进程［28-29］，也可能与miRNA-23b-5p、miRNA-93-3p、miRNA-581和miRNA-23a-5p等4个miRNA结合发挥作用［23］。circHIPK3可能直接与肿瘤抑制因子miR-124结合，抑制miR-124对靶基因的作用，从而发挥致癌作用［30］。可见，在HCC中circRNA也可作为miRNA海绵起调控作用。

3 circRNA与结直肠癌

随着对circRNA研究的深入，circRNA也被发现与结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发生发展有关，其中 circ-ITCH、hsa_circ_001569和hsa_circ_0000069是近年发现的在CRC早期诊断、治疗和预后中具有潜力的生物标志物。HUANG等［31］报道circ-ITCH在结直肠癌组织中的表达较癌旁显著下调，在结直肠癌细胞中也发现下调的circ-ITCH可通过充当miR-7和miR-20a的海绵，抑制经典Wnt通路和c-myc及cyclinD1的表达，从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，为CRC治疗提供了新的思路。而 hsa_circ_001569［32］和hsa_circ_0000069［33］则与之相反，在结直肠癌组织中表达显著上调，其中上调的hsa_circ_001569能海绵吸附miR-145，阻止miR-145与其靶基因E2F5、BAG4和FMNL2结合，并上调这3个靶基因表达，从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，认为靶向miR-145的hsa_circ_001569可能是CRC发生增殖、侵袭的关键因子；而上调的hsa_circ_0000069不仅与CRC患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期相关；在细胞中进行基因敲除也可明显抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并可在体外诱导细胞周期的G0/G1期阻滞，说明hsa_circ_0000069可能是CRC进展的重要调控因子。此外，也有研究发现circ-BANP，hsa-circ-0004771，circ5615等与CRC关系密切，可能是CRC诊断和治疗的潜在标志物［34-36］。

4 circRNA与食管癌

目前食管癌研究中涉及的circRNA较多，包括ciRS-7、hsa_circ_0067934、circ-ITCH、circ_0000337、circUBAP2、hsa_circ_0006168、circ-TTC17、circ0043898、circFNDC3B和circHIPK3等［37-38］20余种，且通过不同机制起作用，是食管癌潜在的诊断、预后指标和治疗靶点。多项研究［39-42］报道，ciRS-7可作为海绵，通过miR-876-5p/MAGE-A，miR-7/HOXB13，miR-7/KLF4/NF-κB和miR-1299/EGFR等多种信号通路起调节作用，促进食管鳞状细胞癌（ESCC）生长和转移，是全新的、有前景的ESCC预后评估指标和治疗靶点。XIA等［43］报道ESCC组织中hsa_circ_0067934表达水平较正常组织显著上调，且上调的hsa_circ_0067934与组织分化程度、T分期、TNM分期呈负相关，还能在体外促进ESCC细胞增殖和迁移，阻滞细胞周期于G2期。circ-ITCH则在ESCC组织中表达下调，同样可通过海绵吸附miR-7、miR-17及miR-214，致使miRNA丧失与ITCH靶基因的结合而使之表达上调，随后促进磷酸化Dv12蛋白的泛素化与降解，阻断Wnt信号通路，抑制ESCC发生与进程［44］，说明这两种circRNA与ESCC的发生与发展密切相关。

5 circRNA与肺癌

肺癌可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌，其中NSCLC是肺癌的主要类型，在我国发病率较高。目前临床对肺癌的筛查主要通过X线胸片、低剂量CT检查等。circRNA具有较高的稳定性、丰度和保守性，可能作为肺癌的非侵入性诊断、治疗和预后监测手段。YAO等［45］检测101例肺癌患者及其配对癌旁组织中hsa_circ_100876的表达，发现癌组织中hsa_circ_100876表达显著上调，且其表达水平与淋巴结转移及肿瘤分期密切相关，进一步随访分析发现 hsa_circ-100876高表达患者的总生存时间较低表达患者明显缩短。在肺癌中，hsa_circ-100876 能充当海绵吸附 miR-136［45］，而circ-ITCH在肺癌组织中显著下调，能海绵吸附miR-7和miR-214，促进靶基因（ITCH）的表达，抑制 Wnt/βcatenin通路激活，从而抑制肺癌细胞增殖［46-47］。此外ZHU等［48］报道hsa_circ_0013958在肺腺癌组织及患者血浆中表达均显著上调，与TNM分期及淋巴结转移呈正相关，ROC曲线分析显示hsa_circ_0013958对肺癌诊断具有高特异性（0.796）和敏感性（0.755），而上调的hsa_circ_0013958能与肿瘤抑制因子miR-134相互作用。说明hsa_circ_0013958作为一种非侵入性的生物标志物，在肺癌的诊断和预后评估中具有良好临床应用价值。

6 circRNA与乳腺癌

早期乳腺癌患者一般预后较好，但晚期、三阴性及耐药性乳腺癌诊治是临床上面临的一大难题［49］。近年来研究者发现circRNA在乳腺癌中也存在差异性表达，这为乳腺癌带来了新的早期诊断和治疗策略。目前在乳腺癌组织中发现的差异表达circRNA约有1 155个，其中715个表达上调（如hsa_circ_103116、hsa_circ_104689和hsa_circ_104821），而 440个表达下调（如hsa_circ_006054、hsa_circ_100219和hsa_circ_406697）［50］。其中circ-Foxo3在乳腺癌组织中的表达水平较良性样本显著下调，并通过影响靶基因Foxo3的表达抑制癌细胞增殖和进展［51］。而circ-ABCB10在乳腺癌组织中则显著上调，在乳腺癌细胞中敲除circ-ABCB10基因可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，作用机制可能是circ-ABCB10充当海绵吸附miR-1271而发挥关键的调控作用［52］。因此在circ-ABCB10可能参与乳腺癌发生发展，有望成为早期诊断和治疗的潜在生物标志物。

7 circRNA与其他肿瘤

除以上研究外，目前还发现circRNA与鼻咽癌、膀胱癌、喉鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤和宫颈癌等肿瘤关系密切。其中在鼻咽癌中circRNA也成为研究热点，circSERPINA3、circ-ZNF609、circRNA CDR1、circ_0008450 等［53-56］多个 circRNA 被报道在鼻咽癌生长和转移中发挥重要作用，可能是潜在的治疗靶点。在膀胱癌中，circ-MYLK和circ-TCF25表达均上调，通过充当海绵作用吸附miRNA，调控相应基因的表达而促进肿瘤细胞增殖和迁移［57-58］，有望作为新的潜在生物标志物。circ_0018289在宫颈癌中也展现了作为疾病监测和预后评估生物标志物的潜力［59］。

8 circRNA研究中面临的机遇与挑战

circRNA具有高度稳定性，能在血液、唾液、尿液、母乳和外泌体等多种体液中检测，例如来源于肿瘤细胞或其他细胞的外泌体circRNA可将生物学信息传递至特定细胞中，实现表型变化的高效传递，从而促进肿瘤转移［60］。同时circRNA也能实时、动态反映患者的疾病状态，且在外泌体中表现更稳定［61］，因此在疾病早期筛查、无创诊断、疗效监控、辅助用药等领域具有广泛的应用前景［62］。此外，随着对circRNA研究越来越多，已知的circRNA数据信息和与之相应的circRNA相关数据库也在快速增长，包括Circbase（http：//www.circbase.org/cgi-bin/listsearch.cgi），Circ2Traits（http：//gyanxet-beta.com/circdb），CircNet（https：//omictools.com/circnet-tool）和RegRNA 2.0（http：//regrna2.mbc.nctu.edu.tw）和CircInteractome（https：//circinteractome.nia.nih.gov）等数据库，且目前已收录了数10万种circRNA测序结果，可预测circRNA-miRNA-mRNA相互作用，这为进一步系统研究circRNA提供了坚实基础。

然而，尽管circRNA具有良好的发展前景，但是目前仍存在诸多挑战：第一，大多circRNA在表达水平较低，未来需要开发更先进、更灵敏的技术和工具检测特定circRNA的分子及其功能［63］；此外，大多数circRNA序列与宿主基因产生的mRNA是同步的，因此技术上也同样面临挑战，如circRNA的量化和验证，过表达和沉默策略等［64］。第二，circRNA命名仍未标性［65］。第三，circRNA在肿瘤中的研究仍处于起步阶段，circRNA的确切功能以及在不同人类癌症中的功能和作用机制仍未明确。因此，未来仍进一步深入研究，使circRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中发挥更大作用，更快实现临床转化。