枯草芽孢杆菌生产β-丙氨酸的基因工程菌构建及其优化研究

周洁静

（崇左市动物疫病预防控制中心，辽宁崇左 532200）

β-丙氨酸是非蛋白氨基酸[1]，不仅是一种医药中间体，可以作为维生素B5、泛酸钙、胍基丙酸和肌肽等药物的原材料，还可以作为食品添加剂，改善食物味道，提高产品质量。β-丙氨酸在机体的糖酵解过程中参与辅酶A的合成，而辅酶A在机体中能够起到激活机体免疫力的功能[2]，促进机体结缔组织的修复和形成。β-丙氨酸一般采用化学方法合成，但这种方法生产的β-丙氨酸中含有大量的无机盐杂质，纯度低，纯化后去掉杂质产量更低[3]。

β-丙氨酸的合成专利在国外，国内使用β-丙氨酸时需要负担一部分专利费用，在大量使用的情况下成本投入也高，运用构建工程菌的方式生产β-丙氨酸，能够降低污染，降低成本，虽前期构建工程菌用时长，但工程菌构建成功后，后期只需投入细菌生长所需要的营养，凭借细菌生命周期短但繁殖速度快的特点，就能够得到源源不断的目的产物。根据工程菌种的不断优化应用，随着产能的不断提升，经济效益也能进一步的提高。

基因工程菌生产氨基酸有较多的优势，比如目的性强，工作量小，局限性不多。具体应用时是利用DNA重组技术，对基因进行定向诱变，然后选择和培育我们需要的基因工程菌。就目前来说，可以利用基因工程菌合成L-色氨酸及其衍生物， L-苏氨酸， L-异亮氨酸等。

枯草芽孢杆菌可以在特定条件下产生芽孢，是革兰氏阳性菌，菌落表面粗糙，繁殖速度快，具有鞭毛，显微镜下观察有活动能力[4]。因为枯草芽孢杆菌可以在极端条件下，诱导产生芽孢，抗逆性很强，而且芽孢可以表达许多酶类和生长因子等多种蛋白，所以可应用在基因工程菌方面。其作为基因工程受体菌，可表达出近200种原核和真核生物来源的蛋白基因，所以应用比较广泛。

1 材料与仪器

1.1 试剂

枯草芽孢杆菌，欧科拜克生物科技股份有限公司；大肠杆菌，上海鲁微科技有限公司；质粒，爱迪基因；载体和引物为自行设计，由上海生物工程公司合成发回；限制性核酸内切酶，上海联迈生物工程有限公司生产；热稳定性DNA聚合酶，威海同丰海洋生物科技有限公司生产；T4DNA连接酶，北京百奥莱博科技有限公司；胶回收试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；PCR产物回收试剂盒Maker蛋白Maker和DNA检测Maker，上海代轩生物科技有限公司；DNA提取试剂盒、buffer（Mg2+）和DNTp，上海生物工程公司生产；蛋白胨、营养琼脂，分析纯，广东环凯微生物工程有限公司；酵母膏，分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司；NaCl，分析纯，天津市鼎盛鑫化工有限公司；蒸馏水。

1.2 培养基配方

蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化钠10 g、琼脂20 g，用可溶性淀粉调节溶液pH至7.0，蒸馏水定容至1000 mL。

1.3 仪器

0.1 ～2.5 μL移液枪、0.5～10 μL移液枪，Eppendorf；ULPHW-I型ULPHW超低有机物（TOC）超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；LDZM-40KCS型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；veriti96PCR仪，美国ABI；DYCZ-24KF型四板垂直电泳仪，北京六一生物科技有限公司；HH-2恒温水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司；S-450D型细胞超声波破碎仪，美国BRANSON；VM200型漩涡振荡仪，托摩根生物科技有限公司；DCW-3510卧式低温恒温槽，上海左乐仪器有限公司。

2 工程菌构建过程

2.1 引物设计与反应体系

用primer5.0设计能够扩增出panD基因的引物，用细菌DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，反应体系50 μL：模板2 μL、上下引物各1.5 μL、10 倍 Buffer（Mg2+）5.5 μL、dNTPs 2 μL、Taq 酶 0.5 μL、超纯水 37 μL。

将混合体系放入PCR扩增仪中进行扩增，温度设置为：预变性95℃，5min；变形94 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s，30个循环；延伸72 ℃，30 s；终延伸72 ℃，10 min；保存 4 ℃；

2.2 检测回收与筛选

进行琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收panD片段，将回收的片段与3种载体分别连接，并制备好大肠杆菌的感受态细胞。为了将3种重组构建载体和片段的连接物成功转移至大肠杆菌内，需提前制备好LB培养基灭菌冷却后，在无菌条件下最大程度上接种2%的菌液，经过培养箱培养后通过蓝白斑筛选法筛选出成功转化的大肠杆菌菌落，挑取菌落，再次进行PCR验证，用试剂盒提取其中的质粒进行测序[5]。

2.3 工程菌构建

实验中选取Hind Ⅲ和EcoR I两个酶切位点分别对质粒和表达载体进行双酶切，使表达载体和细菌质粒具有相同的末端，并用T4噬菌体连接酶连接[6]。将构建好的基因表达载体导入大肠杆菌内，得到能够产生β-丙氨酸蛋白的工程菌。

2.4 工程菌优化

对枯草芽孢杆菌中提取的目的基因进行优化，主要针对其密码子panD进行序列优化，提高目的片段和大肠杆菌的融合度[7]。相应提升目的基因的表达和扩增速度，PCR扩增时设计程序由40 s改为30 s，随着试剂和仪器的更新，缩短反应体系时间也不会对反映效果造成影响[8]。一套反应结束能有15 min的结余，节省了时间，提高了工作效率。

2.5 蛋白表达

得到工程菌后应立即检验β-丙氨酸是否能够进行正常表达，菌液接种培养基后，37 ℃条件下，设置摇床以180 r/min的速度对菌液进行摇床震荡培养。每隔一段时间对菌液进行检测，当菌液检测OD值达到0.5左右时停止培养，向培养基中加入IPTG诱导剂诱导隔夜。收集繁殖后的菌体，用超声破碎仪进行细菌的细胞破碎，随后通过超速离心得到上清液和沉淀物，用SDS-PAGE进行目的蛋白的检测。也可以选择将重组菌液直接接种于自动诱导培养基中，30 ℃左右培养过夜。经过诱导之后的菌液中加入10 mL L型天冬氨酸在相同的条件下进行培养和全细胞转化，1 h后取1 mL菌样加入1 mol/L的氢氧化钠溶液0.1 mL终止反应。

3 结果与分析

取800 μL样品，根据试剂说明书要求，加入A、B衍生剂，旋涡震荡仪震荡3 min，静置45～60 min，用等体积的正丁醇对转化的菌液进行萃取，萃取后的液体用HPLC的方法检测β-丙氨酸。

本实验通过上述方法一共构建了3种工程菌，3种工程菌进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现一号重组工程菌的表达量最差，可溶性最低；2号重组工程菌可溶性最好，表达量较差；3号工程菌可溶性一般，表达量最高。从三种工程菌的表达量和可溶性的差异性来分析原因可能是：（1）不同载体和枯草芽孢杆菌的目的基因亲和力有差异。（2）某些载体上自带的蛋白标签对重组蛋白的表达途径产生阻碍作用。（3）工程菌受体和构建的基因表达载体融合度不够，导致表达量较少。

本实验对工程菌的最初构造目的就是能够得到大量的β-丙氨酸,故在做筛选时目的蛋白的表达量是首要考量，虽然3号菌种的可溶性稍差一些，但是综合考量下，目前情况下第三种工程菌为最优选择。

4 结论

本实验通过构建工程菌的方式来生产β-丙氨酸，在降低了污染，保护了环境的同时也降低了投入成本。虽然前期构建工程菌时的筛选选育等过程用时长，但工程菌构建成功后，后期只需投入细菌生长所需要的营养，凭借细菌生命周期短但繁殖速度快的特点，就能够得到源源不断的目的产物。这种产能方式能够与机械化流程相结合，节省人工成本，高效获得目的产物，根据工程菌种的不断优化应用，产能不断提升，经济效益能够有进一步的提高。