果胶酶研究进展及应用

傅海，赵佳，李伟，孙科，王希信

（1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南 250101；2.济南市锦绣川水库管理处，山东济南 250112）

果胶裂解酶（Pectinases）是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，是一种复合酶，是由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接形成的直链状聚合物，主要用于果蔬汁的澄清、咖啡和茶的发酵生产、榨油、纸浆漂白、棉织物处理、含果胶污水处理、木材防腐、洗涤剂和家禽饲料加工等领域。果胶酶通过切断果胶C-4位置，并且从C-5处消去一个H原子，产生一个不饱和产物裂解果胶。目前果胶酶被广泛的应用于食品、纺织、造纸领域中，但目前果胶酶价格仍然颇高，亟需开发新的高产果胶酶菌株。本文以果胶酶高产菌株的筛选为起点，介绍了果胶酶高产菌株研究的最新进展及应用。

1 果胶酶分类

果胶酶是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，具体可分为原果胶酶（Protopectinases）、聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases）、果胶裂解酶（Pectin lyases，PL）和果胶酯酶等（Pectinesterase，PE）[1]。

目前果胶酶的研究主要有以下三个方面：从野外分离筛选高产菌株；基因重组构建重组菌；生产工艺条件的优化。

1.1 原果胶酶

原果胶是一种通过α-1,4糖苷键连接D-半乳糖醛酸残基，主链中常有阿拉伯聚糖残基、半乳聚糖残基、α-L-吡喃鼠李糖残基等形成侧链将纤维素、半纤维素与蛋白质连接组成的不溶性多糖聚合物[2]。

原果胶酶根据作用的位置不同又可分为A型原果胶酶和B型原果胶酶。A型原果胶酶主要通过水解原果胶内部的多聚半乳糖醛酸，促使原果胶水解。B型原果胶酶对底物有很强的专一性，作用于连接半乳糖醛酸链与细胞壁之间的多糖链[3]。

1.2 聚半乳糖醛酸酶

聚半乳糖醛酸酶是广泛分布于真菌与细菌中的一种果胶酶。在有水参与的条件下，聚半乳糖醛酸酶断裂非酯化半乳糖醛酸间的α-1,4糖苷键。根据水解的机理不同，可分为内切聚半乳糖醛羧酶（E.C.3.2.1.15）与外切聚半乳糖醛酸酶（E.C.3.2.1.67）,内切聚半乳糖醛缩酶随机地从分子内部切断α-1,4糖苷键[4]。反应催化如式1所示。外切聚半乳糖醛缩酶从分子的末端开始，逐一切下产生半乳糖醛酸。反应催化如式2所示。

1.3 果胶裂解酶

果胶裂解酶是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶。果胶裂解酶通过切断果胶C-4位置，并从C-5处消去一个H原子，产生一个不饱和产物裂解果胶。根据作用机理与底物的不同，可分为内切聚半乳糖醛酸裂解酶（EndoPGL，E.C.4.2.2.2）、外切聚半乳糖醛酸裂解酶（ExoPGL，E.C.4.2.2.9）、内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（EndoPMGL，E.C.4.2.2.10）和外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（ExoP-MGL）。

1.4 果胶酯酶

果胶酯酶（E.C.3.1.1.11）能促进脱脂化作用，可脱去半乳糖醛酸主链上的甲基，释放出果胶酸酯与甲醇。反应催化如式3所示。

2 果胶酶的研究进展

目前，果胶酶的研究主要从产果胶酶菌株的筛选、产果胶酶菌株的育种、生产工艺条件优化以及果胶酶固定化4个方面进行。

2.1 产果胶酶菌株的筛选

果胶酶最初是在研究蔬菜腐败时发现[5]，研究发现果胶酶广泛存在于真菌、细菌、原生动物、昆虫中。目前，国内外果胶酶的生产菌种主要来源于微生物，利用霉菌生产果胶酶已经实现了商业化[6]。

微生物产生的酶分为组成酶和诱导酶2种：组成酶是细胞内长期存在的酶，这种酶的合成与生长发育条件无关，常进行定量合成；诱导酶是在环境中存在诱导物（一般是反应的底物）时，受基因调控诱导产生的酶。果胶酶就是一种诱导酶，所以在其筛选过程中，常在培养基中添加果胶作为唯一碳源进行筛选。

常用的产果胶酶菌株筛选方法有高碘酸法、刚果红法、溴酚蓝法，其详细筛选方法如下：（1）高碘酸法。果胶降解产物可以溶于高碘酸，通过向筛选培养基中加入碘液，观察透明圈大小，筛选出透明圈与菌落直径比大的菌株[7]。（2）刚果红法。刚果红可以与大分子多糖结合，产生有色复合物。随着多糖分子量的变化，刚果红结合程度会发生变化，导致颜色从深红到淡黄色的变化。产果胶酶菌株筛选中通过对刚果红染色产生的有色透明圈与菌落直径比筛选菌株。张耀广等[8]利用刚果红染色法从陈化烟叶中筛得多株果胶酶产生菌。（3）溴酚蓝法。酸性条件下，果胶降解物可与溴酚蓝反应生成黄色透明圈，根据透明圈大小可以判定果胶酶活的大小[9]。除了以上方法外，还有人利用加入的1% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）观察水解圈的生成，判定果胶酶产生菌[10]。除了利用显色法与观察有色产物的方法外，还可直接测定果胶酶活性，利用DNS法（二硝基水杨酸法），测量235 nm处吸光值[6]。产果胶酶菌株的筛选方法种类丰富，但主要以显色法观察水解圈为主，具体选择哪一种方法还要根据实验的实际情况与条件确定。

2.2 产果胶酶菌株的育种

为适应工业化生产的需求，果胶酶的研究热点正逐步由菌种筛选的研究转向诱变育种与基因工程菌构建等分子生物学内容。

2.2.1 诱变育种

诱变育种常见的方法有紫外诱变、化学试剂诱变、微波诱变和激光诱变等。由田等研究者[11]以从沤麻池中分离筛选出的HDYM-02菌株为出发菌株，通过紫外诱变，筛得一株在24 h时酶活力为49 U并达到产酶高峰期的菌株UV-21，较出发菌株酶活力提高了1.6倍。杜国军等[12]利用甲基磺酸乙酯（EMS）处理黑曲霉，经过筛选获得了一株产果胶酶能力达到2 290 U/g的高产果胶酶菌株HY-M27，产果胶酶能力是出发菌株的2.91倍。张佰清等[13]在诱变过程中通过响应面试验确定了最佳的脉冲强光诱变条件，脉冲电压2 075 V、脉冲次数36次、脉冲距离5.4 cm，在此条件下筛出的一株高产果胶酶突变菌株L9，酶活力达到（188.21±1.22）U/mL，比出发菌株提高了1.8倍[13]。除了采用单一的突变方式，有研究者尝试采用复合诱变技术，大大提高了产果胶酶菌株的产酶能力。杜国军等[14]采用微波-硫酸二乙酯复合诱变育种的方式，以黑曲霉HY-D7为出发菌株，采用微波与化学试剂硫酸二乙酯作为诱变剂处理黑曲霉孢子悬浮液，经过筛选，得到高产果胶酶菌株HY-Z40，产果胶酶活性是出发菌株的2.51倍。还有研究者采用基因组改组的方式获得了高产果胶酶菌株。陈幸鸽[15]通过多种诱变方式获得正突变菌株，制备原生质体，灭活原生质体后利用PEG（聚乙二醇）诱导融合，进行再生、筛选获得高产果胶酶菌株FS105，酶活性是原始菌株的1.63倍。但诱变育种不确定性较大，往往需要大量的试验才能达到预期目标。

2.2.2 基因工程育种

随着技术的进步，利用基因工程技术重组构建工程菌，大大缩短了从探索到工业应用的时间，避免了传统的诱变育种存在的盲目性。

刘晓肖等[16]全基因合成了来源于类芽孢杆菌的碱性果胶酶基因pel，并将其克隆至pHKA载体上，成功实现其在毕赤酵母GS115中的分泌表达；并对信号肽和启动子进行优化，使得摇瓶发酵诱导168 h，果胶酶酶活性达到432.36 U/mL。何玉兰[17]将黑曲霉果胶裂解酶基因家族的5个果胶裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）成功克隆，筛选得到两个高表达酸性果胶裂解酶基因pelA和pelD，转化菌株SH2-PelA和SH2-PelD，在摇瓶发酵条件下最高酶活性分别为11 069.2 U/mL和8 822.6 U/mL。

2.3 果胶酶发酵工艺优化

通过基因工程技术构建的果胶酶高产菌株，不能直接应用于工业生产，还需进一步对发酵条件进行确定和优化。高产菌株的发酵条件确定常常使用单因素实验法和响应面分析法。王克芬等[18]利用单因素实验法，对枯草芽孢杆菌发酵产酶的碳源、氮源、无机盐、磷酸盐、温度、pH与接种量进行了优化，确定了枯草芽孢杆菌的最优产酶培养基配方为马铃薯淀粉35 g/L、豆饼粉30 g/L、氯化钙2.775 g/L、硫酸锌4.025 g/L、Na2HPO4113.6 g/L和果胶20 g/L；最优发酵控制工艺为发酵温度35 ℃、接种量3%。单因素试验无法考虑因素之间的相互作用，响应曲面设计方法（Response Surface Methodology，RSM）是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。周熠[19]使用响应面分析法，预测最佳条件，将菌株LYS-5304产果胶酶的酶活力从370.71 U/mL提升到809.30 U/mL。

2.4 果胶酶固定化研究

生物酶具有催化活性高、底物专一性强和对环境无污染的优点，但在工业应用中，果胶酶直接加入到生产中，很难再回收利用，提高了生产成本。于是有学者采用了固定化酶技术来提高回收利用率，以降低生产成本。

酶固定化技术通过物理或化学方法将游离酶和相应载体结合起来，从而增强了酶的稳定性，利于保存运输；同时又能将酶与底物分离，达到重复利用、降低成本的目的。常用的物理方法有吸附法、包埋法等；化学方法有共价键结合法、交联法等。漆丹萍等[20]利用吸附法在HPD-750树脂上固定果胶酶后，得到相较游离果胶酶pH适用范围更广泛、热稳定性更好并可以重复使用10次左右的固定化酶。余春柳等[21]用点击化学法制备了固定化漆酶并在催化染料降解方面得到了应用。

3 结语

果胶酶在食品、纺织业与造纸业等行业有广泛的应用，应用效果良好，是一种十分重要的酶，未来应用范围及用量还将不断扩大。但目前价格相对于化学药品仍较为昂贵，为了促进其更好的应用，需要在以下4个方面进行改进：（1）继续筛选、分离纯化优良的野生型果胶酶生产菌株；（2）通过基因工程技术构建新的果胶酶高产菌株；（3）不断优化果胶酶生产菌株的发酵工艺；（4）继续探索更好的果胶酶固定化方式。