硫氢化钠在缓解菘蓝幼苗镉胁迫中的作用

贾红磊，刘华欣，马佩云，王 肖

(陕西科技大学 环境科学与工程学院，陕西 西安 710021)

0 引言

Cd是一种对植物生长有毒害作用的重金属，因其易被植物吸收，在植物体内移动性极强，对植物生长发育危害极大[1]，植物组织内Cd累积会造成体内大量的活性氧产生，影响植物对Ca2+、Mg2+等营养物质的吸收，抑制叶绿素的产生及叶绿体内的电子传递[2-4].Cd通过损伤植物细胞分裂，破坏酶活结构等方式直接或间接来抑制植物生理过程，最终抑制植物生长或导致植物死亡[5].

H2S是继NO、CO之后发现的第三种气体信号分子，H2S的作用在动物体内的各种生理功能及在治疗各心血管疾病与高血压等疾病上的重大功效均已有较大进展[6,7].目前，在H2S调节植物的生理功能及生长发育方面的研究逐渐深入.研究表明，H2S不仅参与植物生理生长调控，如通过调节植物气孔运动，增强植物光合作用等来促进植物生长[8,9]，也可提高植物对抗逆境胁迫的适应性，如H2S可缓解重金属胁迫、盐胁迫、低温胁迫、活性氧胁迫、非生物胁迫等[10-14].Bharwana等研究发现H2S可提高棉花株高、叶面积、叶绿素含量并降低棉花组织中Pb的含量，以此来缓解Pb胁迫对棉花造成的伤害[15].由此可见，H2S可缓解植物因各种生物胁迫、非生物胁迫造成的损害，但因H2S在植物体内的具体作用机制的研究尚不明确，有报道盐胁迫会影响菘蓝幼苗生长生理，会影响菘蓝幼苗体内抗氧化酶系统酶活性，进而对菘蓝幼苗造成伤害[16,17].而在重金属胁迫下H2S对菘蓝幼苗缓解作用的研究较少.

本研究以菘蓝幼苗为研究对象，用NaHS作为H2S的外源供体，在水培条件下探究H2S缓解Cd胁迫的最适浓度，并在最适H2S缓解浓度下，以不同的Cd浓度加以验证.探究Cd胁迫下外源H2S对菘蓝幼苗生长生理的影响，分析H2S在缓解提高菘蓝幼苗对Cd胁迫抗性的作用，为菘蓝幼苗应对Cd胁迫提供理论依据.

1 实验部分

1.1 材料及培养

菘蓝种子购于安国市万草同源苗木花卉有限公司，挑选饱满种子于37 ℃温水中浸泡0.5～1 h后，均匀置于装有蛭石的穴盘中，待有真叶长出时，将其移至含有1/4 Hoagland营养液的水培箱中进行培养.培养条件为光照16 h，黑暗8 h，相对湿度40%～60%，温度为26±2 ℃(昼)，20±2 ℃(夜).

1.2 实验方法

1.2.1 Cd胁迫下不同浓度硫化氢对菘蓝幼苗指标的测定

(1)幼苗株高的测定

待菘蓝幼苗在含有1/4 Hoagland营养液的水培箱中长至四片真叶时，挑选长势一致的壮苗分别移至含有1/2 Hoagland营养液的水培处理罐中处理7天，对幼苗进行成像，并用 Image-J测量幼苗植株长度[18].设置十组处理，分别为空白处理罐，含有(50μmol·L-1NaHS、100μmol·L-1NaHS、150μmol·L-1NaHS、200μmol·L-1NaHS、5 mg·L-1CdCl2、5 mg·L-1CdCl2+50μmol·L-1NaHS、5 mg·L-1CdCl2+100μmol·L-1NaHS、5 mg·L-1CdCl2+150μmol·L-1NaHS、5 mg·L-1CdCl2+200μmol·L-1NaHS)的水培处理罐.

(2)幼苗不同部位Cd含量测定

将长至四片真叶、挑选长势一致的菘蓝幼苗分别移至含有1/2 Hoagland营养液不同处理的水培处理罐中处理7天，处理同1.2.1(1).收集菘蓝幼苗根分别用0.5 mmol·L-1的EDTA-Na2浸泡15 min，将处理后收集菘蓝幼苗的地上部分、地下部分，105 ℃杀青后，80 ℃烘干至恒重.称0.1 g干样置于消解管中，80 ℃消解1.5 h，120 ℃消解1.5 h，150 ℃消解3 h，而后在175 ℃下加酸溶解，将液体转移至10 mL容量瓶中，用1% HNO3定容，定容后溶液用0.45μm滤膜过滤备用，用原子吸收光谱仪(AAS)进行Cd含量测定.

1.2.2 Cd胁迫下不同浓度硫化氢对菘蓝幼苗指标的测定

(1)幼苗株高的测定

测定方法同1.2.1(1)中植株高度测定，在含有1/2 Hoagland营养液的水培处理罐中处理七天.设置八组处理，分别为空白处理罐，含有(150μmol·L-1NaHS、1.0 mg·L-1CdCl2、2.5 mg·L-1CdCl2、5.0 mg·L-1CdCl2、1.0 mg·L-1CdCl2+150μmol·L-1NaHS、2.5 mg·L-1CdCl2+150μmol·L-1NaHS、5.0 mg·L-1CdCl2+150μmol·L-1NaHS)的水培处理罐.

(2)幼苗不同部位Cd含量测定

处理方法同1.2.2(1).测定方法同1.2.1(2)中Cd含量测定.

(3)幼苗叶绿素含量测定

处理方法同1.2.2(1).测定方法采取95%乙醇提取法，带提取液制备完成后，在波长665 nm、649 nm、470 nm下，以95%乙醇为空白，测定叶绿体色素提取液的吸光度.

1.3 数据分析

本实验数据统计分析使用Origin 9.1、Image J及SPSS 17.0软件进行统计分析和显著性分析.所有实验数据均为三次实验均值.

2 结果与讨论

2.1 Cd胁迫下不同浓度H2S对菘蓝幼苗的影响

2.1.1 对菘蓝幼苗株高的影响

重金属Cd对植物生长发育的影响主要表现在植株矮小、生长缓慢、生物量下降等，主要由于Cd影响植物进行光合作用过程中所必需的叶绿素脂还原酶的活性，从而导致叶绿素含量的降低[19].H2S作为气体信号分子，H2S参与植物种子萌发及生长发育和过程[20].高浓度的Cd会影响芝麻及芥菜型油菜根系生长及幼苗的生长[21,22].

在本实验条件下，菘蓝幼苗的植株高度如图1 所示.5 mg·L-1的Cd处理与对照组相比，植株高度降低26.60%，说明5 mg·L-1浓度的Cd会明显抑制菘蓝幼苗的生长，此浓度下加入不同浓度的NaHS发现，150μmol·L-1和200μmol·L-1NaHS处理组下菘蓝幼苗较Cd对照组相比植株高度有显著性上升，分别增加了14.44%、14.41%，说明外源H2S在一定程度上可以缓解由于Cd胁迫导致的菘蓝幼苗植株生长抑制.

2.1.2 对菘蓝幼苗体内Cd分布的影响

硫化氢能够诱导植物体内产生螯合肽(phytochelatin PC)、金属硫蛋白(metallothinein MT)降低重金属离子的转运效率[23].如图2所示，不同浓度的NaHS对Cd在菘蓝幼苗根部的富集具有促进作用，与加入5 mg·L-1的Cd处理相比较，外源添加50μmol·L-1NaHS、100μmol·L-1NaHS、150μmol·L-1NaHS、200μmol·L-1NaHS各处理组地下部分中Cd含量增加42.97%、77.29%、187.54%、137.44%；地上部分中Cd含量分别降低1.87%、27.35%、44.26%、29.48%.可以看出，当NaHS浓度为150μmol·L-1时.大部分Cd被富集在菘蓝幼苗的根部，同时菘蓝幼苗地上部分中Cd含量最低.说明外源H2S可通过将Cd富集在菘蓝幼苗的根部以减少Cd向上的运输，此时转运系数降至最低为0.078 26，如图3所示.因此，选定150μmol·L-1NaHS继续后续实验.

(a)Cd胁迫下不同浓度H2S对菘蓝幼苗地上部分中Cd含量

(b)Cd胁迫下不同浓度H2S对菘蓝幼苗地下部分中Cd含量图2 Cd胁迫下不同浓度H2S对菘蓝幼苗地上、地下部分中Cd含量

图3 Cd胁迫下不同浓度H2S对菘蓝幼苗体内Cd的转运系数的影响

2.2 不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗生长的影响

2.2.1 对菘蓝幼苗株高的影响

当外源H2S供体NaHS的最佳浓度确定为150μmol·L-1后，本实验设置了对照组、不同浓度的Cd胁迫处理组及加入NaHS的缓解处理组.如图4 所示，与对照组相比，不同浓度Cd处理后，菘蓝幼苗株高分别降低了22.07%、33.56%、31.33%，加入NaHS后，株高较各组Cd对照组相比分别升高了8.47%、12.49%、5.08%.这与2.1中实验结果相一致，棉花在Pb胁迫下，外源添加NaHS会缓解因Pb对棉花幼苗造成的株高、叶面积、生物量下降的胁迫[15].说明添加H2S供体NaHS可以缓解菘蓝幼苗因Cd胁迫造成的损伤.

图4不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗株高的影响

2.2.2 对菘蓝幼苗叶绿素的影响

重金属胁迫会诱导植物体内超氧自由基(ROS)爆发，超氧自由基能够直接或间接导致细胞质膜的过氧化作用，进而导致细胞膜的损伤[3]；超氧自由基也可能会抑制了光合叶绿素所需叶绿素酸酯还原酶的活性[19]，从而导致叶绿素含量下降及叶绿素a+b值的降低.有研究表明Cd会降低芝麻、决明子及棉花中叶绿素的含量及叶绿素a+b值[3,15,21].

如图5所示，不同浓度Cd处理后，与对照组相比均显著性下降，叶绿素a含量分别降低了38.28%、32.17%、12.08%；叶绿素b含量分别降低了22.42%、28.3%、1.17%；，类胡萝卜素含量分别降低了53.75%、42.45%、58.02%，在添加H2S外援供体NaHS后，1.0 mol·L-1CdCl2、1.5 mol·L-1CdCl2处理组与其各自Cd对照组相比叶绿素a含量分别升高了45.42%、24.14%；叶绿素b含量分别升高了53.09%、34.17%；类胡萝卜素含量分别升高了38.86%、36.51%.而加入NaHS的5.0 mg·L-1CdCl2的处理组叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量分别降低了38.14%、8.64%、54.31%.H2S为气体信号分子，在低浓度下有促进植物生长发育的作用，当Cd浓度达到5.0 mol·L-1时，植物生长状态较差，Cd引起菘蓝幼苗生长异常，导致幼苗对H2S更加敏感，此时H2S可能表现出对菘蓝幼苗的毒性作用，而并非缓解Cd胁迫的作用.

(a)不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗叶绿素a含量的影响

(b)不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗叶绿素b含量的影响

(c)不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗类胡萝卜素含量的影响

(d)不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗叶绿素a+b含量的影响图5 不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗叶绿素含量的影响

2.2.3 对菘蓝幼苗不同部位Cd的影响

有研究表明，H2S能显著降低棉花幼苗根、茎、叶中Pb的含量[15].在本实验中，如图6 所示，外源添加NaHS后，菘蓝幼苗地下部分较各自Cd胁迫对照组分别增加了34.40%、34.60%、41.76%，地上部分较各自Cd胁迫对照组分别减少了52.84%、46.69%、43.23%.

(a)不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗地上部分中Cd含量的影响

(b)不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗地下部分中Cd含量的影响图6 不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗中Cd含量的影响

如图7所示，外源添加NaHS后，菘蓝幼苗体内Cd的转运系数均显著性降低，说明H2S通过将Cd富集在菘蓝幼苗的根部，减少地上部分中Cd的积累来缓解Cd对菘蓝幼苗造成的胁迫.

图7 不同浓度Cd胁迫下H2S对菘蓝幼苗体内Cd的转运系数的影响

3 结论