越鞠丸对侧脑室注射链脲佐菌素诱导的学习记忆损伤小鼠模型的神经保护作用

王姗姗，赵佳惠，张训乐，丁 郁，张 洋，郭小燕，薛文达，黄家情，闻 妩，陈 刚，贡岳松*

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种神经退行性疾病，其病理特征为β淀粉样蛋白异常沉积形成斑块，tau蛋白过度磷酸化形成缠结的神经纤维以及炎症、氧化应激、神经元及突触体丢失[1]。脑内胰岛素信号通路障碍可诱发学习记忆功能下降、Aβ沉积、tau过度磷酸化、突触功能异常等[2-3]。

链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)在外周破坏B细胞导致胰岛素抵抗，诱导糖尿病症状，在中枢可以使认知记忆相关的脑区胰岛素受体表达下降，导致认知障碍、学习记忆损伤、神经元丢失等散发性AD样病变[4-6]。所以，侧脑室注射STZ被用于制造AD样损伤模型[7]。

神经突触的丢失是AD记忆损伤的结构基础[8-9]。突触后膜致密区(PSD)对维持正常神经突触结构和功能以及学习记忆至关重要。PSD95是PSD结构的标志性蛋白[10]，敲除PSD95小鼠会出现学习记忆障碍[11]。此外，刺激谷氨酸受体NMDAR和由此产生一氧化氮(NO)的高效生成连接PSD95来调节恐惧记忆[12]。Shank3是PSD结构的支架蛋白，在突触结构的维持中起着核心作用[13-14]，而PSD95和Shank3蛋白在AD中明显缺失[15-16]，可能直接影响突触功能、学习记忆和恐惧记忆[17-18]。目前，治疗AD的药物乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂都无法改善AD的发病进程[19-20]。

越鞠丸记载于元代朱丹溪的《丹溪心法》，由苍术、香附、川芎、神曲、栀子五味药组成。越鞠丸重在理气解郁，兼顾六郁(汪昂《医方集解》)。实验表明，越鞠丸可以改善记忆障碍，并且显著上调帕金森病抑郁模型小鼠前额皮层突触可塑性相关蛋白水平，增强突触可塑性[21-22]。

本实验采用侧脑室注射链脲佐菌素(ICV-STZ)建立AD小鼠模型，探讨越鞠丸对其学习记忆损伤以及恐惧记忆的改善作用及对大脑皮层PSD95和Shank3蛋白表达的影响。

1 材料

1.1 实验动物 清洁级雄性ICR小鼠，体重28～30 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司南京分公司提供。实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2016-0003。

1.2 药物与试剂 STZ(美国Sigma公司，批号：160901)，越鞠丸(购于南京中医药大学国医堂门诊部，批号：160901，将药丸用粉碎机粉碎，按0.2 kg/L与生理盐水充分混合后，超声1 h，放入4 ℃冰箱保存备用)，PSD95(美国CST，批号：3450)，Shank3(SANTA CRUZ，批号：sc-30193)及β-actin(美国CST，批号：3700)，二抗Goat Anti-Mouse、Goat Anti-Rabbit(博士德生物公司，批号：BA1050、BA1054)，蛋白定量BCA试剂盒(上海碧云天生物研究所，批号：P0010)，超敏ECL发光液试剂盒(上海天能科技有限公司，批号：180-5001)。

1.3 仪器 SLY-WMS型的Morris水迷宫(北京市硕林苑科技有限责任公司)、多功能水平电泳槽(天能HE-120)、电泳仪(天能EPS-300)、转移电泳槽(天能VE-186)、垂直电泳槽(天能VE-180B)、纯水超纯水系统(Elix ESSENTIAL 3/SYNERGY，赛飞中国有限公司)、超声波细胞粉碎仪(Biosafer900-92，赛飞中国有限公司)、凝胶成像系统(Tanon 5200 Multi，上海天能科技有限公司)、条件恐惧系统(Coulbourn恐惧条件系统，武汉普百康科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 侧脑室注射STZ诱导小鼠学习以及损伤模型的建立及越鞠丸给药 将小鼠随机分为4组：正常对照组(Control)、假手术组(Sham)、模型组(Model)和越鞠丸治疗组(Yueju)。侧脑室注射，注射位点位于两眼连线中点垂直向后2 mm，垂直中线旁开1.5 mm，垂直颅骨进针2.5 mm。造模完成后越鞠丸治疗组给予越鞠丸[2.0 g/(kg·d)]灌胃治疗，其余组给予相同体积生理盐水，每天1次，连续给药6周[23]。

2.2 血糖值测定 每周对小鼠禁食不禁水1次，通过尾静脉采血，用三诺血糖仪测定血糖值。

2.3 Morris水迷宫试验 小鼠给药6周后，所有小鼠进行Morris水迷宫实验。此实验历时5 d，前4 d是训练期，每只小鼠每天训练4次。每次从不同的标记处入水，将小鼠面向池壁放入，记录60 s。若60 s内未能找到平台，则用细竹竿引导至平台，并让小鼠在平台上待15 s，每次从平台上拿出的小鼠放入空鼠笼中。第5天实验期，每只小鼠只放入池中1次，每只随机抽取标记点放入，记录60 s内寻找平台所需时间(逃避潜伏期)。若小鼠入水后60 s内未能找到平台，逃避潜伏期记录为60 s，数据采集和处理由Morris水迷宫图像自动监视系统处理。

2.4 条件恐惧实验 Morris水迷宫实验结束后，进行条件恐惧实验。整个实验历时3 d，第1天是条件训练期(声音刺激加点刺激)，设定的程序如下：小鼠放入实验箱后，首先是3 min的适应期，让小鼠在实验箱内自由活动。适应期结束后为声音刺激(Tone音，2.5 Hz，85 dB)，持续刺激30 s，声音刺激结束后紧跟电刺激(0.75 mA)，持续2 s，然后中间空白2 min，即无声音刺激和电刺激。以上声音刺激-电刺激-无任何刺激过程重复6次(共7次，时长1 244 s)。实验过程中软件会自动采集并记录小鼠活动度等情况。24 h后进行Contextual期，将小鼠放入实验箱中，无声音刺激和电刺激，让其自由活动，时长1 200 s。第3天进行记忆测试(声音刺激)，实验箱中环境做出改变，栅栏上和对角线加上纸板保证实验箱中内环境与前2 d不一样。设置测试条件：恐惧箱内室灯开启，小鼠自由活动并适应3 min，声音刺激(Tone音，2.5 Hz，85 dB)持续刺激30 s后中间停止2 min，不给予任何刺激，2 min后再次给予声音刺激，即声音刺激30 s-无刺激，整个过程重复9次，整个实验一共10次，总时长为1 680 s。在整个实验过程中要保证外部环境安静，在隔绝外界干扰噪音的情况下进行操作。

2.5 蛋白免疫印迹试验检测突触相关蛋白 条件恐惧实验结束后，颈椎离断处死各组小鼠，在冰上快速取脑，放入-80 ℃冰箱中冻存。取出冻存的皮层组织，加入1% SDS、PMSF及磷酸酶抑制剂，用超声波破碎仪进行破碎裂解(功率为360 W，超声时间2 s，间隙时间3 s，持续2 min)，裂解后的组织于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清，用BCA法测蛋白浓度以制备样品。SDS-PAGE电泳，NC膜湿转，5%牛奶封闭，室温1 h。加入稀释好的一抗(1∶2 000)，4 ℃过夜。洗膜，辣根过氧化物酶标记二抗(1∶10 000)室温下孵育2 h，ECL发光显色；扫描仪扫描电泳条带，Image J软件进行结果条带的处理和分析。

3 结果

3.1 越鞠丸对小鼠空腹血糖的影响 侧脑室注射STZ小鼠空腹血糖注射前后差异无统计学意义，与文献报道一致[24-25]，表明侧脑室注射STZ对机体血糖水平无明显影响。灌胃越鞠丸不改变小鼠血糖水平。见图1。

图1 灌胃越鞠丸后各组血糖水平

3.2 越鞠丸对小鼠学习记忆能力的影响 前4 d训练过程中，各组的平均潜伏期日渐缩短。训练至第3天开始，与正常对照组相比，模型组的平均潜伏期明显延长(P<0.05)，说明模型成功。而越鞠丸治疗组与模型组相比潜伏期明显缩短(P<0.05)，说明给予越鞠丸后小鼠空间学习记忆能力得到改善。见图2。

图2 越鞠丸对侧脑室注射STZ小鼠模型学习记忆的影响

注：A.小鼠在训练和测试试验期间的学习记忆情况；B.小鼠在空间探索实验中找到平台的时间。与Model组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Sham组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.3 越鞠丸对小鼠恐惧记忆的影响 条件恐惧系统实验结果显示，侧脑室注射STZ可以降低小鼠僵直时间百分比，即小鼠恐惧记忆异常降低，而给予越鞠丸可以增加其僵直时间百分比(P<0.05)，提示越鞠丸可以改善侧脑室注射STZ导致的恐惧记忆异常。见图3。

图3 越鞠丸对侧脑室注射STZ小鼠模型恐惧记忆的影响

3.4 越鞠丸对小鼠皮层组织突触蛋白PSD95和Shank3的影响 Western blot检测小鼠大脑皮层PSD95和shank3的表达。采用特异性抗体检测小鼠大脑皮层组织PSD95和Shank3的表达，与内参相比，模型组小鼠皮层组织中PSD95和Shank3均低于正常对照组(P<0.05)，长期给予越鞠丸改善了STZ引起的PSD95和Shank3蛋白水平的降低。见图4。

4 讨论

目前，FDA批准用于治疗AD的药物有乙酰胆碱酯酶抑制剂(他克林、利伐斯的、加兰他敏、多奈哌齐)和NMDA受体拮抗剂(美金刚)。美金刚是FDA唯一批准用于中重度AD的药物，可以保护神经元，防止NMDA受体介导的过度兴奋性毒性对其造成损伤[20]，然而，美金刚无法改善AD的发病进程，且无法治愈AD[19]。本实验发现，越鞠丸对小鼠学习记忆的损伤有明显的改善作用，还可以调节恐惧记忆，以及保护突触蛋白PSD95和Shank3，从而对AD症状有良好的改善作用。

图4 Western blot检测小鼠皮层PSD95和Shank3蛋白的表达水平

STZ是亚硝基脲类衍生物，在外周可以选择性破坏胰岛细胞导致糖尿病；在中枢可引起胰岛素受体信号传导系统功能紊乱，导致脑葡萄糖代谢异常和能量生成减少。另外，脑室注射STZ还可导致脑内Aβ表达增加[26]，影响突触的结构和功能蛋白的表达，降低PSD95和Shank蛋白水平[25]。PSD95是PSD结构的标志性蛋白，是决定兴奋性突触结构和功能完整性的主要支架蛋白，是神经发育过程中参与谷氨酸能传递、突触可塑性和树突状脊柱形态形成的重要成分[10]。PSD95在发育过程中的功能障碍可能会改变树突棘上的突触可塑性，而突触可塑性异常使学习记忆功能障碍导致AD的发生。研究报道，敲除PSD95小鼠会表现出空间学习记忆障碍和长时程增强[11]。Shank3是PSD结构的支架蛋白，促进兴奋性突触的形成和树突棘的发育，在突触结构的维持中起着核心作用[13-14]。PSD95和Shank3表达下降会导致突触功能异常，而突触功能异常与AD患者临床认知功能下降最为相关，是记忆早期损伤的结构基础，突触丢失与痴呆严重程度密切相关[8-9]。因此，侧脑室注射STZ影响突触信号转导和突触可塑性，造成记忆丢失，引起小鼠学习记忆损伤等AD样神经退行性改变[27]。

恐惧记忆与抑郁的关系密切相关，研究表明，压力、应激障碍等会增强恐惧记忆反射增强，而这些因素会提高抑郁症的发病风险。氯胺酮作为经典的抗抑郁药物，可以加速恐惧记忆的消退[28]。越鞠丸在快速抗抑郁方面有很好的疗效，同时也可以改善记忆障碍，上调突触可塑性相关蛋白的表达水平，增强突触可塑性。而正常的突触功能以及突触可塑性与记忆功能关系密切。

本实验小鼠侧脑室注射STZ后，小鼠血糖没有发生变化，但在Morris水迷宫试验中，小鼠找到水下平台所需时间与假手术组相比明显延长，说明侧脑室注射STZ可直接诱导小鼠学习记忆障碍且不引起血糖变化。给予越鞠丸后小鼠潜伏期明显缩短，提示越鞠丸对侧脑室注射STZ所致的记忆损伤小鼠模型具有一定的保护作用。Western blot结果显示，ICV-STZ小鼠大脑皮层内PSD95、Shank3蛋白水平降低，与文献一致[25,29]。给予越鞠丸后PSD95、Shank3蛋白水平增加并接近假手术组。此外，侧脑室注射STZ导致恐惧记忆异常下降，而越鞠丸可以改善其异常。

综上所述，STZ侧脑室注射导致小鼠学习记忆能力减退，越鞠丸灌胃可以明显减轻ICV-STZ对小鼠学习记忆的损伤，对恐惧记忆的异常也有明显的调节作用，其机制可能与增加小鼠大脑皮层组织PSD95、Shank3蛋白水平以及保护突触功能相关。本研究为越鞠丸用于AD防治的后续研究提供了一定的药理学依据，但是具体的作用机制尚不清楚，有待进一步探究。