差示扫描量热法在对照品纯度分析中的应用—以大环内酯类抗生素为例

翟铁伟

0 引言

热分析技术是指采用如等速升降温、恒温等程序控温手段来检测物质的温度和物理化学性质关系的一种技术[1-2]。此项技术具有操作简单、灵敏度高、快速等优点，而且可以与其他分析方法联合对物质相关性质进行测定。使用该技术可以检测药物在冷却或加热过程中所发生的物理或化学变化并予以分析，能够提供可靠的参数供药物分析使用[3-5]。

差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry，DSC) 是指对输给参比物质和供试品热量差和温度间的关系进行测量的一项技术，属于热分析技术的一种，其在测定药物的纯度、熔点和多晶型等多个检测项目中发挥着重要的作用[6-9]。定值是化学药品对照品研究中最重要的部分，通常采用质量平衡法。其中最关键的部分是对主要杂质进行分析，在标准物质研究中也常被称为纯度分析。色谱法是检测化学药品对照品纯度最常用的方法，但当样品存在未知杂质而其检测响应值出现差异或色谱法分离效果有限时，则杂质含量可能无法被准确测定[10]。需要检测总杂质绝对含量时，尤其是含有一定杂质的低共熔体系，采用属于热分析技术的DSC是一种准确可靠的技术方法。其具有操作简单、所需试样量少、快速、不需溶剂以及适合高纯物分析等特点，尤其适用于化学药品对照品的纯度分析[11-13]。本实验旨在探讨DSC在大环内酯类抗生素(克拉霉素,罗红霉素)对照品纯度分析中的应用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 克拉霉素(批号:100507-201802)、罗红霉素(批号:100504-201802)、二氢脱氧青蒿素(批号:100184-201802)和巯嘌呤(批号:100197-201803) 均购自中国食品药品检定研究院。

1.1.2 主要仪器 热重/差示(TGA/DSC1)同步热分析仪、DSC823e 差示扫描量热仪、ME-T 电子分析天平、标准铝坩锅40 μl：瑞士梅特勒-托利多(Mettler Toledo)公司；LC 16 高效液相色谱仪(配有Class VP 色谱工作站、岛津二极管阵列检测器)：日本岛津公司；916 型电位滴定仪：瑞士万通(Metrohm)公司。

1.2 方法

1.2.1 差示扫描量热分析 在标准铝坩锅内放入克拉霉素及罗红霉素样品各约1～5 mg，升温速率设定为10 ℃/min和0.5 ℃/min，控制氮气流速为50 ml/min,以10 ℃/min的宽温度范围进行扫描分析，由Mettler Toledo 公司的STARe分析软件计算样品纯度。

1.2.2 高效液相色谱分析 参考国家药品标准，克拉霉素：系统适用性试验与色谱条件下填充剂使用十八烷基硅烷键合硅胶；以乙腈-磷酸盐缓冲液(称量磷酸二氢钾9.11 g，加水溶解并稀释至1 000 ml，加三乙胺2 ml，用磷酸调节pH值至5.5)(60∶40)为流动相；柱温45 ℃；检测波长为210 nm。理论板数不低于3 000；拖尾因子不得超过2.0；克拉霉素峰与相邻杂质峰的分离度应良好。测定法：精密称取适量克拉霉素，用流动相溶解稀释制成浓度为0.35 mg/ml的待测溶液，精密吸取20 μl注入高效液相色谱仪，进行纯度分析。罗红霉素：系统适用性试验与色谱条件下填充剂使用十八烷基硅烷键合硅胶；以乙腈-磷酸盐缓冲液(配制方法同上)(65∶35)为流动相；柱温45 ℃；检测波长为210 nm。理论板数不低于3 000；拖尾因子不得超过2.0；罗红霉素峰与相邻杂质峰的分离度应良好。测定法：精密称取适量罗红霉素，用流动相溶解稀释制成浓度为0.35 mg/ml的待测溶液，精密吸取20 μl注入高效液相色谱仪，进行纯度分析。

1.2.3 热重/差示扫描量热同步分析(TGA/DSC) 在标准铝坩锅内放入二氢脱氧青蒿素和巯嘌呤样品各约2.0 mg，设置温度范围30～500 ℃，升温速率为10 ℃/min，控制氮气流速为50 ml/min，采用TGA/DSC1 同步热分析仪进行扫描分析。

2 结果

2.1 差示扫描量热分析结果 10 ℃/min的宽温度范围扫描分析，结果显示，克拉霉素和罗红霉素均为单一熔融吸热峰(图1)；随后进行针对性温度窗口试验(图2)，使用DSC纯度分析软件对克拉霉素熔融吸热峰进行分析，升温速度0.5 ℃/min，总面积500.6 mJ，起始熔点213 ℃，峰顶温度220 ℃，测得纯度为99.9%。对罗红霉素熔融吸热峰进行纯度分析，升温速度0.5 ℃/min，总面积218.1 mJ，起始熔点203 ℃，峰顶温度210 ℃，测得纯度为99.8%。

图1 克拉霉素和罗红霉素的DSC 图

图2 克拉霉素和罗红霉素的DSC 图

2.2 高效液相色谱分析结果 HPLC 分析结果显示，克拉霉素及罗红霉素的纯度均为100.0% (图3、图4)。

图3 克拉霉素的HPLC图

图4 罗红霉素的HPLC图

2.3 热重/差示扫描量热同步分析结果 由二氢脱氧青蒿素的TGA/DSC 热分析曲线可以发现，样品在温度为140 ℃左右因分解放热而导致显著失重，且在出现降解前无明显的熔融过程，因此，二氢脱氧青蒿素样品无法进行DSC纯度分析(图5)。由巯嘌呤的TGA/DSC热分析曲线可以发现，样品起始熔点253.0 ℃，达峰温度258.5 ℃，样品于256 ℃因热降解出现显著失重，以及于259 ℃发生熔融同时分解放热，因此，巯嘌呤样品热稳定性较差，也不适合再进行DSC纯度分析(图6)。

图5 二氢脱氧青蒿素的TGA/DSC图

图6 巯嘌呤的TGA/DSC图

3 讨论

在通常情况下对化学药品对照品进行定值定量应采用质量平衡法，即测得的主成分含量加上无机、有机杂质、水分及残留溶剂之和应为100%[14]。在纯度分析中，对有机杂质的含量进行分析通常采用色谱法，但如果有未知杂质存在于样品中时，由于不同物质响应值存在着一定差别，或因分离效果有限，那么有机杂质的含量将很可能无法被准确测定，导致所测得的结果可能与真值相比偏倚较大。研究表明，对于高纯物质的分析，尤其是化学药品对照品的纯度分析，DSC 法尤其适用，其检测结果与其他方法(例如色谱法)测得的结果基本一致，其结果可能优于其他方法[15-17]。

有机杂质，在药品质量标准中又被称为有关物质，是化学药品对照品中的主要杂质。有机杂质主要为化学药品对照品合成过程中所掺入的原料药、副产物和降解产物等，这些相关物质通常与主成分具有相似的理化性质，给纯度分析工作带来了一定困难[18]。当DSC适用时，能给化学药品对照品的纯度分析提供一种简便的方法，而且能够给其他分析手段提供一个有益的补充。当面对品量稀少、价格昂贵的标准物质的品种时，DSC 法相比于其他纯度分析方法更具有独特的优势。因为杂质会影响物质的熔融行为，多数有机物都为低共熔体系，在此体系中低共熔杂质越多，熔程越宽，熔点越低。一般来说，纯度越高，DSC曲线峰形越敏锐。采用DSC 技术进行纯度分析就是利用物质的DSC 熔融曲线计算该物质的杂质含量。物质纯度与DSC 峰形存在一定的相关性，峰形在一定程度上能反映纯度，纯度能决定峰形，任何能够影响峰形的因素都将会影响物质的纯度测定结果[19]。随着对化学药品对照品DSC 纯度分析研究的不断深入，化学药品对照品的量值结果分析将会更加精确。

热重/差示扫描量热同步分析发现部分化学药品对照品热稳定性较差，存在热分解前无明显熔融过程或熔融分解等(如图4和图5)，因此，此类化学药品对照品不适合进行DSC 纯度分析。此外，在克服干扰因子(水分、多晶型等)前，在进行纯度分析时也不宜采用DSC。但采用DSC进行纯度分析具有操作简单、所需试样量少、快速、无需溶剂以及适合高纯物分析等独特优点，尤其适用于化学药品对照品的纯度分析[20]。

在本研究中，克拉霉素及罗红霉素的DSC纯度分析结果与HPLC纯度分析没有明显差异，基于热力学原理的DSC 与HPLC 色谱的紫外纯度分析结果基本一致，DSC 纯度分析为该大环内酯类抗生素量值和质量分析研究提供了可靠的技术支持，可见属于热分析技术的DSC 纯度分析在抗生素对照品研究中有着广阔的应用前景。