UHPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中山萘酚的药物浓度及药动力学研究

肖丹丹，衣 洁，王晓颖，段青娅，李 倩

0 引言

山萘酚(kaempferol)又名山萘素、山萘黄素、山柰黄酮醇、猫眼草素、百蕊草素Ⅲ、四羟基黄酮，属于黄酮醇类化合物[1-2]，主要来源姜科植物山萘的根茎，广泛存在于各种植物的根、叶及果实中，是银杏叶提取物中重要的活性成分[3-5]。山萘酚的分子式为C15H10O6,结构式见图1。山萘酚具有如抗癌、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗菌、抗病毒、抗癫痫、抗风湿等多种药理活性[6-12]，目前在临床治疗上具有较好的应用前景。虽然目前国内外已有采用高效液相色谱法(HPLC)来测定山萘酚的质量浓度，但因其灵敏度低、专属性差等，不能满足生物样品检测的要求。本实验采用高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定大鼠血浆中山萘酚的质量浓度，用于山萘酚在大鼠体内的血药浓度检测及药代动力学研究，进而为体内药动学及临床研究提供参考依据。

图1 山萘酚化学结构式

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent超高效液相色谱仪-质谱联用仪(Agilent 1290超高效液相色谱仪，Agilent 6430A质谱仪)，配有API4000三重四级杆及电喷雾离子化源(ESI)；S4202S型精密天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；SK7200LH型超声仪(上海千载科技有限公司)；CJ15RE型低温离心机(日本HITACHI公司)；Vortex-Genie2型涡旋仪(美国Scientific Industries)。

1.2 试剂 山萘酚对照品(西安天丰生物有限公司，含量98.2%，CAS号：520-18-3)，和厚朴酚对照品(阿拉丁，含量≥98%，CAS号：35354-74-6)，乙腈、甲醇(色谱纯，MERDA，美国)，异丙醇、甲酸(色谱纯，TEDIA，美国)，羧甲基纤维素钠(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)。

1.3 实验动物 实验动物为健康雄性SD大鼠[(180±10)g]，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。该动物中心已经通过国际动物委员会(IACUC)批准。

2 实验方法

2.1 色谱条件 采用ZORBAX SB-C18(2.1 mm×30 mm，3.5 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相，梯度洗脱(0～8.0 min，30%A；8.0～15.0 min，30%A→90%A；15.0～16.0 min，90%A→30%A；16.0～20.0 min，30%A)，流速为0.3 ml/min，柱温为25 ℃，进样量为5 μl。

2.2 质谱条件 采用电喷雾ESI离子源，选择负离子扫描方式及多反应离子监测(MRM)模式测定，离子源喷雾电压4 000 V，离子源温度300 ℃，雾化气15 psi，碰撞气为高纯氮气，流速为11 L/min，碎裂电压为135 V，碰撞能分别为40 V(山萘酚)、25 V(内标物)。

2.3 溶液的制备

2.3.1 山萘酚对照品储备液的制备 精密称取山萘酚对照品12.5 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500 μg/ml的山萘酚对照品储备液，置4 ℃冷藏备用。

2.3.2 内标储备液的制备 精密称取和厚朴酚对照品5.0 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为200 μg/ml的内标储备液，置4 ℃冷藏备用。

2.3.3 山萘酚对照品溶液的制备 精密量取上述山萘酚对照品储备液适量，用甲醇稀释并制成终浓度为0.4、0.8、20.0、100.0 μg/ml的山萘酚对照品溶液，置4 ℃冷藏备用。

2.3.4 血浆样品预处理 精密量取大鼠血浆100 μl于1.5 ml的离心管中，加入内标储备液10 μl，涡旋30 s，加入600 μl异丙醇，再涡旋5 min，于10 000 r/min离心10 min，吸取上清液于离心管中，37 ℃氮气吹干，然后加入200 μl甲醇复溶，涡旋5 min，过滤，取上清液测定。

2.3.5 QC样品的制备 精密量取山萘酚对照品储备液适量于1.5 ml离心管中，加入100 μl空白血浆，加入10 μl内标储备液，涡旋30 s后，按“2.3.4”项下方法进行处理，制成终浓度分别为0.4、1.5、6.0、12.0、20.0、25.0、50.0、100.0 μg/ml的QC样品，置4 ℃冷藏备用。

3 实验结果

3.1 方法学验证

3.1.1 专属性实验 取空白血浆100 μl，除不加内标外，按“2.3.4”项下方法操作，取上清液进行UHPLC-MS/MS分析，同时将一定浓度的山萘酚对照品溶液和内标溶液加入到空白血浆中，依同法操作,山萘酚和内标物二级碎片离子图见图2,血浆样品色谱图见图3。结果显示，山萘酚与内标物分离度较好，且内源性物质对待测组分无干扰，基线较平稳。

3.1.2 基质效应考察 取空白血浆适量，除不加内标外，按“2.3.4”项下方法进行处理，制成空白溶液，再分别加入“2.3”项下的山萘酚对照品储备液和内标储备液，配成终浓度为0.4、0.8、20.0、100.0 μg/ml的QC样品各6份，进样分析，获得相应色谱峰峰面积，将测得的峰面积与用甲醇配制的相当浓度的各对照品溶液(含内标)直接进样后所得的面积的百分比计算基质效应。结果见表1。结果表明，该基质效应符合生物样品测定要求，可忽略不计。

3.1.3 线性关系、定量下限考察 精密量取山萘酚对照品储备液适量于1.5 ml离心管中，加入100 μl空白血浆，加入10 μl内标储备液，涡旋30 s，后按“2.3.4”项下方法进行处理，配成终浓度为0.4、1.5、6.0、12.0、20.0、25.0、50.0、100.0 μg/ml的QC样品，分别注入液质联用仪，以QC样品中山萘酚的浓度为横坐标，山萘酚和内标物的峰面积比值为纵坐标，进行线性回归。求得回归方程为y=0.001 2x-0.000 8(r=0.999 8)，结果显示，山萘酚质量浓度在0.40～100.0 μg/ml范围内线性关系良好，定量下限为0.4 μg/ml。

图2 大鼠血浆样品中山萘酚和内标物的二级碎片离子图

图3 大鼠血浆样品中山萘酚和内标物的色谱图

表1 山萘酚在大鼠血浆中的基质效应(n=6)

3.1.4 精密度与准确度 精密量取山萘酚对照品储备液适量于1.5 ml离心管中，加入100 μl空白血浆，加入10 μl内标储备液，涡旋30 s，后按“2.3.4”项下方法进行处理，配成终浓度为0.4、0.80、20.0、100.0 μg/ml的QC样品各5份，连续测定3 d，根据标准曲线计算血浆样品中山萘酚的质量浓度，求得日内、日间精密度和准确度，结果见表2。结果显示，方法的准确度和精密度良好，符合生物样品测定要求。

表2 准确度与精密度测定结果(n=5)

3.1.5 提取回收率 精密量取山萘酚对照品储备液适量于1.5 ml离心管中，加入100 μl空白血浆，加入10 μl内标储备液，涡旋30 s，后按“2.3.4”项下方法进行处理，配成终浓度为0.4、20.0、100.0 μg/ml的QC样品各5份，进行分析，测定峰面积A；取空白血浆适量，除不加内标外，按“2.3.3”项下方法进行处理，制成空白溶液，再分别加入“2.3”项下的山萘酚对照品储备液和内标储备液适量，配成终浓度为0.4、20.0、100.0 μg/ml的样品各5份，进行分析，测定峰面积B，以A/B×100%计算提取回收率，结果见表3。

表3 提取回收率测定结果(n=5)

3.1.6 稳定性 按“2.3.4”项下方法配制低、中、高3种浓度(0.4、20.0、100.0 μg/ml)的QC样品各5份，测定在3次冻融循环和室温放置24 h后的稳定性，结果见表4。结果表明，山萘酚在室温条件下放置24 h及3次冻融循环状态下均无明显降解。

表4 稳定性实验结果(n=5)

3.2 分析方法在药动学中的应用

3.2.1 给药方案及血浆样品测定 健康雄性SD大鼠18只，体重约(180±10)g，随机分为3组，每组各6只，灌胃给药。灌胃前禁食12 h，自由饮水，单次灌胃给予50 g/L的山萘酚混悬液(5 g/L的CMC-Na溶液)，给药剂量依次为150、200、250 mg/kg，分别于给药前0 h和给药后0.25、0.5、1、2、4、6、9、12、24、48 h于眼球后静脉丛取血300 μl，血样收集到肝素化的1.5 ml EP管中，4 000 r/min离心10 min，分离得到血浆，存于EP管中，置-20 ℃冰箱保存备用。按“2.3.4”项下方法处理各时间点血浆样品，进样分析，平均血药浓度-时间曲线见图4。

图4 山萘酚经口服给药后在大鼠中的平均血药浓度-时间曲线

3.2.2 药动学评价 采用药动学处理软件DAS2.0对药-时曲线进行拟合,应用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，药动学参数见表5。

表5 山萘酚经口服给药后大鼠体内药动学参数(n=6)

4 讨论

目前报道的有关山萘酚的体内定量分析的文献较少，并且这些方法具有操作繁琐、专属性差、灵敏度低等缺点。本实验采用电喷雾离子源以及MRM检测方式，充分地利用了UHPLC-MS-MS操作简便、快速准确、专属性强、灵敏度高的分离能力，用于大鼠血浆样品中血药浓度测定。选择流动相时，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液，结果表明采用乙腈-甲酸水溶液作为流动相，响应较高，峰型良好，背景噪声低。同时考察了不同体积分数的甲酸水溶液对测定的影响，发现随着甲酸浓度的增加，仪器响应变低，因此，最终以乙腈-0.1%甲酸水溶液作为测定血浆中待测物的流动相。

本实验采用UHPLC-MS/MS法用于山萘酚经灌胃给药后在大鼠体内的药动学研究，经过方法学考察可知，在0.4～100 μg/ml血药浓度范围内线性关系良好，所测生物样品的基质效应、精密度与准确度、提取回收率、溶液稳定性均满足生物样品测定的要求。该方法简单快速、灵敏度及准确度高，可满足生物样品分析的要求，适用于山萘酚在大鼠体内的血药浓度检测及药代动力学研究，为进一步的临床应用提供参考依据。

根据药时曲线和药动学参数可以看出，经灌胃给药后，山萘酚在大鼠体内的药动学行为属于二室开放模型，山萘酚经口服吸收后迅速入血，但由达峰时间可推测出山萘酚在胃肠道吸收速率较慢，可能与山萘酚较低的溶解度有关，而山萘酚在体内的消除速率较缓慢，可能与药物代谢P450酶有关，这也将是我们下一步工作研究的重点。