一测多评法测定枇杷止咳软胶囊中硫酸吗啡和磷酸可待因的含量及其应用拓展

★ 李晶 陈超 文萍 虞金宝

(江西省中医药研究院 南昌 330046)

枇杷止咳软胶囊经由部颁标准第17册收载的“枇杷止咳胶囊”改变剂型而成，处方由枇杷叶、百部、白前、桑白皮、桔梗、罂粟壳、薄荷脑组成，功能止嗽化痰，用于咳嗽、支气管炎。罂粟壳为方中主药，功能敛肺止咳，涩肠定痛。其主要含吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因等生物碱[1]，刘永利等[2-3]在测定不同产地及不同等级罂粟壳生物碱类成分含量研究中发现，诸多罂粟壳所含的生物碱中以吗啡和可待因含量较高，该二者对于咳嗽中枢均有明显的抑制作用，是其镇咳的有效成分，也是成瘾性成分[4-5]。收载于中国药典2010年版及2015年版一部的罂粟壳药材仅建立了吗啡的含量测定方法及限度标准[6-7]。鉴于中药独特的多成分、多靶点作用特点，同时考虑到吗啡和可待因作为国家规定管制药品的成瘾性和危害性的特殊性质，为了更准确地把控产品质量，需可待因的含量测定方法的研究。本研究同时考察硫酸吗啡和磷酸可待因含量的方法学，并且依据该2种成分内在的函数和比例关系，采用一测多评的方法，以硫酸吗啡为对照，通过相对校正因子计算磷酸可待因的含量。该研究为枇杷止咳软胶囊的质量控制提供了新的评价模式，此外，通过将该一测多评法应用于同样含罂粟壳的强力枇杷露的验证比较，以期为一测多评法对于同类药物制剂的拓展应用奠定实验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 HP-1100高效液相色谱仪(美国：包括1322A在线脱气机、G1311A四元梯度泵、G1315B二极管阵列检测器、HP化学工作站)，CQ-250超声波清洗器(上海船舶电子设备研究所)，SimplicityTM型超纯水系统(Millipore公司)，AG-135电子天平(梅特勒--托利多仪器上海有限公司)。

1.2 材料 硫酸吗啡对照品(含量测定用，批号：171238-200303，中国食品药品检定研究院)，磷酸可待因对照品(含量测定用，批号：171203-200303，中国食品药品检定研究院)；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。枇杷止咳软胶囊(江西津正药业有限公司，0.55g/粒)；强力枇杷露(江西远东药业有限公司，100mL/支)。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液 取硫酸吗啡和磷酸可待因对照品各约10mg，精密称定，以甲醇溶解并稀释成质量浓度为每1mL含硫酸吗啡1.015mg、磷酸可待因0.555mg的混合对照品储备溶液。精密吸取储备液1mL于25mL容量瓶并加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取本品内容物适量，研匀，取约1.5g，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇至近刻度，超声(功率250w，频率33kHz)处理15min，放冷，以甲醇加至刻度，摇匀，滤过，取续滤液15mL加至中性氧化铝柱(3g，100～200目，内径为1cm)，用100mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取适量以微孔滤膜(0.45μm)滤过，续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 阴性供试品溶液 取枇杷止咳软胶囊制剂处方中缺罂粟壳的其它药材按制剂处方比例及工艺制备罂粟壳阴性制剂，并以其依"2.1.2"项下供试品溶液方法制得阴性供试品溶液。

2.2 色谱条件的选择 色谱柱：Dikma Diamonsil C18(4.6mm×250mm, 5μm)，流动相：乙腈-水(水相为0.01mol·L-1磷酸氢二钠和0.005mol·L-1庚烷磺酸钠水溶液)(25∶75)，流速：1mL·min-1，检测波长220nm。在此条件下，供试品溶液色谱图中呈现硫酸吗啡与磷酸可待因对照品相同保留时间的色谱峰，且与其它相邻色谱峰均能获得分离度大于2.0的较好分离，同时测定阴性供试品溶液未出现干扰此二种成分的色谱峰，见图1。

图1 对照品-供试品-阴性HPLC图

2.3 线性范围 取"2.2.1"项下混合对照品储备溶液分别稀释至体积为6.25、10、12.5、25、50、100倍量，配制成不同浓度的混合对照品溶液。分别吸取10μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，将样品浓度与峰面积进行回归，发现硫酸吗啡和磷酸可待因在一定浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系，结果见表1。

表1 对照品线性关系(n=2)

2.4 精密度 精密吸取同一混合对照品溶液10μL，按上述色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，计算硫酸吗啡和磷酸可待因峰面积值RSD分别为1.31%和1.12%(n=6)。表明仪器性能稳定。

2.5 稳定性 精密吸取同一供试品溶液10μL，于0、1、2、4、8、12、24h分别测定，结果供试品中硫酸吗啡和磷酸可待因峰面积的RSD分别为1.48%和1.29%。表明24h内供试品溶液稳定性良好。

2.6 重复性试验 取制剂(批号：20160101)6份，照2.2.2项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，测定并计算硫酸吗啡和磷酸可待因含量分别为0.2283mg·粒-1和0.0365mg·粒-1，RSD分别为0.96%和2.13%。

2.7 加样回收率试验 取本品适量，研细，取约0.75g，共6份，精密称定，分别置25mL容量瓶中，各精密加入每1mL含0.06215mg硫酸吗啡和0.01237mg磷酸可待因的混合对照品溶液4mL、5mL、6mL，余按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定并计算回收率，硫酸吗啡与磷酸可待因平均回收率分别为100.24%和100.62%，RSD分别为1.08%和2.11%，具体如表2。

表2 加样回收率试验

2.8 校正因子的确定

2.8.1 相对校正因子(RCF) 以硫酸吗啡为内参物，根据相对校正因子计算公式[3]，计算磷酸可待因与内参物的相对校正因子，结果见表3。

表3 待测物质RCF结果(n=2 )

2.8.2 校正因子重现性 为检验所确定的RCF对于常规检验的适用性，我们进行了一测多评法校正因子的耐用性和系统适应性评价。取2.3项下不同浓度的混合对照品溶液分别进样测定，通过考察不同色谱仪器、不同型号色谱柱以及改变流动相比例、流速和柱温对RCF的影响发现不同条件下已确定的RCF重现性较好，各组平均值结果为0.849～0.867，RSD均在3%以内，表明所建立的一测多评法耐用性良好。

2.8.3 色谱峰定位 色谱峰的定位通常可采用相对保留值法[5]确定，利用硫酸吗啡的保留时间结合磷酸可待因的相对保留值及其特征光谱，即可对色谱峰进行定位，通过考察相对保留值在不同品牌色谱仪和色谱柱中的重现性，其中磷酸可待因对硫酸吗啡的相对保留时间在2.66～2.75，RSD为1.40%。

2.8.3 样品测定 取枇杷止咳软胶囊，按2.2.2项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。测定10批样品中硫酸吗啡和磷酸可待因含量，结果如表4，经对比外标法实测值与QAMS的计算值，发现两种方法含量值之间以Correl相关系数计算为0.999006，无显著性差异，因此通过QAMS进行多指标成分评价枇杷止咳软胶囊的质量方法可行。

表4 外标法与QAMS测定结果(n=2) mg·粒-1

3 应用拓展适用性

鉴于一测多评法是根据中药有效成分间存在的内在函数关系，通过仅测定1个易得对照品成分来实现没有或难以供应的多个对照品成分的同步监控[5]，我们同时探索了含罂粟壳制剂强力枇杷露中硫酸吗啡和磷酸可待因的一测多评法适用性，经对比验证10批制剂外标法实测值与QAMS计算值Correl相关系数为0.999209，并且相对误差均小于3.0%，表明该QAMS法同样适用于强力枇杷露中该2种成分的含量测定。结果见表5。

表5 外标法与QAMS测定结果(n=2) mg·mL-1

4 讨论

根据生物碱的酸碱性，在制备供试品溶液时，常采用酸碱处理后用氯仿提取，以除去较多的杂质，但由于吗啡具有两性酚基结构，能与酸或强碱生成水溶性较大的盐，且具有较强还原性，易被氧化变质，因而使其在任何pH条件下均不能被完全提取[6]。根据相关报道[7-8]，实验中分别采取调碱后用乙酸乙酯萃取、调碱后用三氯甲烷萃取、调碱三氯甲烷萃取后上氧化铝柱与甲醇提取后直接上氧化铝柱四种方法制备吗啡和可待因的供试品溶液。结果证实，采用后者进样测定硫酸吗啡含量约提高两倍，磷酸可待因含量无明显差异。

参考文献[9-12]流动相，分别比较0.05mol·L-1醋酸钠缓冲液(用冰醋酸调pH至3.6)-乙腈-甲醇(22∶2∶1), 0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈-甲醇(51∶4∶45)磷酸调pH至3.0、甲醇-水(水相为0.49%醋酸铵，0.02%三乙胺)(30∶70), 0 .03 mol·L-1醋酸钠(冰醋酸调pH 至3 .50)-甲醇(70∶30)，由于在220 nm处甲醇的噪音大且样品中硫酸吗啡和磷酸可待因的峰形不好。参照中国药典(2005版)一部中吗啡的含量测定方法，我们采用乙腈-水(水相为0.01mol·L-1磷酸氢二钠和0.005mol·L-1庚烷磺酸钠水溶液)(25∶75)为流动相进行比较，后者较前者噪音小，且更稳定。因此，采用乙腈-水(水相为0.01mol·L-1磷酸氢二钠和0.005mol·L-1庚烷磺酸钠水溶液)(25∶75)为流动相。此外还分别对提取方法(振摇和超声)、提取时间和洗脱溶剂用量等条件进行考察, 结果表明, 硫酸吗啡和磷酸可待因以 25mL甲醇超声提取15min经过中性氧化铝柱以100mL甲醇洗脱效果最好。

相对校正因子确立的重现性实验中，我们先后考察了RCF在Agilent1100和Shimadzo LC-20AT两种不同品牌液相色谱仪，三种不同品牌的色谱柱(Dikma Diamonsil C18，Welch C18和Elite Hypersil ODS)，三种不同比例流动相乙腈：水(水相为0.01mol·L-1磷酸氢二钠和0.005mol·L-1庚烷磺酸钠水溶液)(24∶76、25∶75、26∶74)，不同流速(0.9、1.0和1.1mL·min-1)以及不同柱温(25℃、30℃、35℃)条件下进行了分别测定。在一测定多评的应用拓展研究中，通过将已定的RCF用于评价强力枇杷露进行验证，结果显示外标法测定值与一测多评法计算值亦无明显差异，说明在文中线性范围内，基于枇杷止咳软胶囊建立的一测多评法对强力枇杷露具有通用性和准确性，并推测其可能为其他含罂粟壳制剂一测多评质量控制技术的建立提供借鉴。