艾灸对阿尔茨海默病模型大鼠血脑屏障结构与学习记忆功能的影响*

周 翠， 李檬妤， 刘朝霞， 李克荣， 叶 红， 雷丽芳， 陈琰姝， 许奕华

(1. 华中科技大学同济医学院公共卫生学院， 湖北 武汉 430030； 2. 湖北省襄阳市中医医院， 襄阳 441000； 3. 广东省中医院， 广州 510120)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种发病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。据报道，65岁以上老年人AD的患病率约为6%，且患病人数持续上升，预计到2050年，全球AD患者将从目前的5000万人增加至1.4亿人[1]。目前，临床上AD的治疗除了常规药物治疗外，针灸的疗效也得到充分肯定[2]。艾灸作为传统中医疗法之一，在治疗神经退行性疾病方面有独特优势，可减轻药物的毒副作用，改善患者躯体化症候群，稳定患者情绪[3]。然而，尽管临床上已广泛使用艾灸治疗AD，但其基础实验方面研究仍相对较少，且集中于对动物行为学的影响。血脑屏障是血液与脑组织间的特殊屏障，能阻止有害物质进入脑内而损伤神经元，血脑屏障的损伤是AD、帕金森症等神经退行性疾病脑部的重要病理特征之一[4]。因此，本研究拟建立AD大鼠模型，通过以血脑屏障结构与功能变化为研究点，明确艾灸对AD的治疗作用及潜在机制，为艾灸治疗AD的基础研究及临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，48只，体质量为180～220 g，由华中科技大学动物实验中心提供，生产许可证号为SCXK(鄂)2016-0009。实验期间大鼠均饲养在室温(24±2)℃、相对湿度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的标准环境中，自由摄食饮水。

1.2 试剂与主要仪器

Aβ25-35购自美国Sigma公司；兔抗鼠MMP-2、MMP-9多克隆抗体购自英国Abcam公司；DAB试剂盒、苏木素购自北京中杉金桥；山羊抗兔二抗购自武汉博士德；清艾条购自苏州医疗用品有限公司；DW-2000型脑立体定位仪、TM-Vision动物学习记忆系统购自成都泰盟有限公司；Primotech普通光学显微镜购自德国ZEISS公司；H800透射电镜购自日本日立公司；MK3型酶标仪、HM355S组织切片机购自美国Thermo公司。

1.3 动物分组与造模

大鼠适应性喂养3 d后，根据体质量值随机分为4组，包括正常对照组、假手术组、模型组及艾灸组，每组12只。模型组及艾灸组均采用双侧海马一次性注射聚集态Aβ25-35的方法建立AD大鼠模型[5]，具体操作如下：大鼠麻醉后，将其头部固定于脑立体定位仪上，脑部皮肤消毒后，剪开头皮以露出颅骨，以前囟为坐标原点，分别定位两侧海马区(X：±2.1 mm，Y：-3.5 mm，Z：-2.7 mm)；采用颅钻于定位处钻孔，然后将微量进样器垂直插入，缓慢注射1 μl聚集态的Aβ25-35液(5 μg/μl)，留针5 min，使Aβ25-35液充分浸润周围组织；缝合大鼠脑部皮肤，撒青霉素粉末防止感染。假手术组大鼠于相同部位注射等量生理盐水，正常对照组正常饲养。

1.4 艾灸治疗

于造模完成后24 h开始艾灸治疗，参照林文注主编的《实验针灸学》分别选取“百会”、“肾俞”、“印堂”穴，于穴上方2～3 cm处艾条温和灸，每穴艾灸10 min，每天1次，持续治疗21 d。除艾灸组外，其余各组大鼠均不予以治疗。

1.5 Morris水迷宫测试

于治疗第17日开始在Morris水迷宫中进行定位航行实验，连续4 d，以评价大鼠的学习记忆功能，具体方法如下：将水迷宫均匀划分为4个区域，在左下方区域水面上2 cm处放置一个暗色平台，将大鼠于右上方面向池壁放入，记录其找到平台的时间(逃避潜伏期)，若60 s内未找到，则将其引导至平台，停留5 s；在连续4 d学习后，于治疗第21日进行空间探索实验，评价大鼠的记忆能力，具体方法为：撤去平台，依然将大鼠从右上方面向池壁放入，记录其60 s内在原平台所在区域的停留时间(空间探索时间)。

1.6 血脑屏障的通透性检测

采用伊文思蓝实验检测大鼠血脑屏障的通透性，评价其损伤程度。于取材前1 h给予大鼠尾静脉注射2%的伊文思蓝(4 ml/kg)，大鼠皮肤、四肢变蓝表示注入成功。1 h后麻醉大鼠，生理盐水灌注完成后断头取脑，称重，置于5 ml甲酰胺溶液中，54℃恒温培养箱中孵育24 h，离心，取上清，酶标仪测定其630 nm处的吸光度值，计算脑组织中伊文思蓝含量(μg/g)。

1.7 透射电镜观察

大鼠麻醉后，打开胸腔，经左心室依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛，灌注完成后，剥离出海马组织，切取大小约1 mm3块状，用2.5%戊二醛和1%锇酸固定，丙酮逐级脱水，包埋剂包埋，超薄切片(50 nm)，采用醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察并摄片。

1.8 免疫组化实验

取固定好的大鼠脑组织，常规石蜡包埋后以5 μm连续切片，常规脱蜡，水化，滴加山羊血清封闭液，37℃孵育30 min，去除血清，加一抗(1∶100稀释)4℃孵育过夜；PBS洗3次，滴加HRP标记的山羊抗兔50 μl，37℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，树胶封片，显微镜下观察(200倍)。选取3个不同的视野，借助Image Pro软件计算海马MMP-2及MMP-9的平均阳性细胞数。每组检测6个样本。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 艾灸对AD模型大鼠学习记忆功能的影响

在定位航行实验中， 随着训练时间的延长，各组大鼠逃避潜伏期时间均有不同时间的缩短，第4日时，模型组大鼠逃避潜伏期时间较对照组和假手术组显著延长(P<0.01)，学习功能受损，而艾灸治疗能增强模型大鼠的学习记忆功能(P<0.05)；在第5日的空间探索实验中，模型组大鼠在原平台所在象限停留时间明显变少(P<0.01)，学习记忆功能受损，而艾灸治疗能延长其探索时间(P<0.05，表1)，改善学习记忆功能。

Tab. 1 Comparison of learning and memory ability of rats in each group (s, n=12)

**P<0.01vscontrol or sham；#P<0.05vsmodel

2.2 艾灸对AD模型大鼠血脑屏障通透性的影响

正常对照组和假手术组大鼠脑组织伊文思蓝的含量分别为(2.95±0.31)μg/g和(3.28±0.39)μg/g，而模型组大鼠脑组织伊文思蓝含量为(8.76± 1.02)μg/g，显著高于前两组(P<0.01)，表明血脑屏障通透性增加；在艾灸治疗后，伊文思蓝含量为 (5.24±0.61)μg/g，与模型组比较显著下降(P< 0.05)，说明血脑屏障功能得到一定程度的修复。

2.3 艾灸对AD模型大鼠血脑屏障超微结构的影响

正常对照组和假手术组大鼠血管内皮细胞胞膜完整清晰，核仁形态规则，细胞连续性较好，基底膜厚度均匀，未见血管周围有水肿现象；模型组大鼠血管内皮细胞边界模糊，管腔狭窄，基底膜增厚，部分区域撕裂，血管周围明显水肿变大；艾灸组大鼠血管周围水肿明显减轻，仅局部轻微水肿，基底膜厚度恢复正常，内皮细胞形态趋于完整，血脑屏障损伤情况整体得到改善(图1)。

Fig.1Electron microscopic observation of blood-brain barrier of each group of rats (×25 000)

2.4 艾灸对AD模型大鼠海马MMP-2和MMP-9表达的影响

与正常对照组和假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区神经元缺失明显，细胞排列散乱，MMP-2和MMP-9阳性细胞数均显著增加(P<0.01)；艾灸治疗后，海马CA1区神经元数量增加，排列较为整齐，整体损伤情况得到缓解，同时MMP-2和MMP-9阳性细胞数均有所减少(P<0.05或P<0.01，图2-3，表2)。

Fig.2Immunohistochemical staining results of hippocampal MMP-2 in each group of rats (×200)

Fig.3Immunohistochemical staining results of hippocampal MMP-9 in each group of rats (×200)

GroupMMP-2 MMP-9 Control29.84±4.9226.34±3.80Sham27.64±5.31 30.29±4.81Model48.90±5.92∗∗ 51.02±6.07∗∗Moxibustion38.76±5.01#34.91±4.63##

**P<0.01vscontrol or sham；#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 讨论

AD的治疗目前仍是世界医学难题，临床主要以胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂两类药物为主，尽管在延缓疾病的进程进展上疗效显著，但对患者神经功能的恢复作用仍十分有限[6]。同时，西药长期服用所产生的不良反应及药物的依赖性反而容易使患者产生严重的心理压力，甚至并发抑郁症状，加重AD的病程[7]。目前，西药联合针灸治疗AD在临床上已十分常见，艾灸属于中医针灸疗法中的灸法，以熏烤人体的穴位而达到保健治病、延缓衰老的功效。中医认为，AD的关键病机为肾精亏虚、髓海不足，与脑、肾相关，而“百会”、“肾俞”、“印堂”穴正是与脑、肾关系密切的穴位，灸之能扶正祛邪、益肾补脑、壮髓醒神[8]。本研究在建立AD大鼠模型的基础上，通过持续21 d的艾灸治疗，发现模型大鼠的学习与记忆功能均得到改善，疗效明显。

血脑屏障是血液与脑组织间的一种特殊屏障，是一个复杂的细胞系统，主要功能是阻止有害物质进入脑内，同时让营养物质及代谢产物等选择性通过，从而维持脑组织内环境的稳定[9]。在多种神经系统疾病尤其是神经退行性疾病中，血脑屏障的结构与功能通常都受到损坏，导致局部通透性增加，脑组织内环境紊乱，最终造成神经元的损伤[10-11]。研究表明，血脑屏障渗透性的增加会促进老年斑的加速形成，加重AD的疾病进程[12]。Arbo BD等[13]研究发现，血脑屏障受损后，负责将Aβ转出脑组织的主要载体LRP1和P-gp表达减少，而将Aβ由血管内转入脑组织的糖基化终产物受体RAGE增加，促进Aβ脑内聚集和沉积，并进一步加重血脑屏障的损伤。由此可见，Aβ的聚积与血脑屏障的损伤互为因果，均与AD的发生发展相关联。基质金属蛋白酶类(MMPs)是能通过降解血管内皮细胞外基质而广泛参与血脑屏障的破坏过程，其中MMP-2和MMP-9降解能力最强，研究也最为深入，是评价血脑屏障完整性的关键指标[14]。本研究中，在双侧海马注射Aβ25-35后，大鼠脑内血管周围明显水肿变大，内皮细胞边界模糊，基底膜增厚，伊文思蓝含量及MMP-2、MMP-9阳性表达均显著增加，说明AD模型大鼠血脑屏障结构与功能均受到明显损坏，与文献报道一致[15]；在艾灸治疗后，模型大鼠血脑屏障损伤得以改善，通透性降低，MMP-2和MMP-9表达下降，对血脑屏障的完整性起到很好的保护作用。

综上，本研究表明，艾灸能显著改善AD模型大鼠的学习记忆能力，其作用可能与调节MMP-2和MMP-9的表达，保护血脑屏障结构与功能有关。本研究结果对于艾灸治疗AD的实验研究与临床应用提供了理论依据，但艾灸治疗AD更深入的分子机制有待进一步研究。