小鼠ESCs诱导分化的研究

文│相荣科（北京农学院、山东省兰陵县畜牧发展促进中心）

马永艳 梁树凯（山东省兰陵县畜牧发展促进中心）

高建明 穆祥（北京农学院）

胚胎干细胞（ESCs）作为一种全能性细胞，可体外培养无限增殖，并自我更新和向多种细胞分化。对于不能再生的心肌细胞，若能通过诱导ESCs分化为纯度高的心肌细胞，参与心肌的再生及修复，在加快其在临床上的应用及治疗心脏疾病方面具有极其重要意义。淫羊藿苷（ICA）作为一种生物活性较强的中药提取物，可改善心脑血管的血流量、改善心血管系统功能、诱导肿瘤细胞及干细胞分化等，还可诱导ESCs分化为心肌细胞。

微血管内皮作为内分泌器官，其代谢非常活跃，可调节体内生理功能及多种生物应答，并可分泌多种细胞因子，在组成血管组织屏障、维持机体生理、调节内环境的稳态、调节免疫功能、介导疾病（发生、发展和转归）等方面发挥非常重要作用，并且促进干细胞的增殖及分化。本试验重在探索小鼠微血管内皮细胞（hMVECs）条件液及ICA对ESCs分化的作用，在ESCs分化培养液中添加hMVECs条件液、ICA、ICA联合hMVECs条件液，探索hMVECs条件液能否诱导ESCs分化为心肌样细胞；ICA与hMVECs条件液联合诱导，探讨二者对ESCs向心肌样细胞分化是否有综合作用，从而进步提高心肌样细胞分化率及纯度，体外生产批量心肌细胞，为研究心肌发育、心肌药物筛选与心肌损伤治疗等方面提供一条新思路。观察ICA、hMVECs条件液诱导mESCs（小鼠ESCs）分化小鼠胚胎干细胞为心肌样细胞效果。

本试验以m E S C s 分化培养液为空白对照组，分别用10-7摩尔/升ICA、50% hMVECs条件液、10-7摩尔/升ICA联合50% hMVECs条件液诱导mESCs的分化，对诱导后的mESCs继续培养1周，用免疫化学方法及RT-PCR鉴定诱导后细胞中心肌特异性蛋白（cTnT）及基因（MLC-2v、α-MHC、β-MHC、Nkx2.5、GATA-4）的表达，并用cTnT算出分化率。各实验组诱导后细胞中均有c T n T 及以上5 种心肌特异性基因表达，其中分化率ICA组（44.35±3.84）和联合诱导组（44.93±0.86）均极显著高于hMVECs条件液组（5.46±1.24）（P＜0.01）。hMVECs条件液可体外诱导mESCs分化成心肌样细胞，二者联合未能显著提高分化率。

一、材料和方法

1.材料及试剂。mESCs（广州赛业）、昆明白小鼠（6～8周龄SPF级，北京实验动物中心）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF，自制）、SP试剂盒（中国医学科学院）、DAB试剂盒（Solarbio）、RT-PCR试剂用品（北京全式金）、引物（北京奥科）、丝裂霉素-C（Roche）、β-巯基乙醇（β-ME，Amreco）、胎牛血清（FBS，四季清）、0.25%Trypsin-EDTA消化液和特级FBS（Giboc），其他药品均购自sigma公司。MEF培养液：H-DMEM+10%FBS+100IU/毫升青霉素+1 0 0 微克/毫升链霉素。ESCs培养液：H-DMEM+FBS（20%）+β-ME（0.1毫摩尔/升）+L-谷氨酰胺（2毫摩尔/升）+青霉素（100IU/毫升）+链霉素（100微克/毫升）+非必需氨基酸（1%）+白血病抑制因子（LIF，10纳克/毫升）。ESCs分化培养液为不含LIF的ESCs培养液。

2.饲养层制备及ESCs培养。用常规方法剥离孕12.5～14.5天小鼠子宫内胎鼠躯干，0.25%胰酶消化。用MEF培养基制成细胞悬液，在37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜，细胞长至80%融合时进行1∶3传代。饲养层制备选用3～5代的MEF，用10微克/毫升丝裂霉素-C处理2小时后备用。将ESCs接种于MEF饲养层上培养。

3.ESCs体外分化培养。消化后的ESCs以5×104/毫升的浓度接种到24孔板中，在ESCs分化培养液培养3天后，对ESCs细胞进行诱导。诱导组为以下三组：10-7摩尔/升ICA诱导24小时，用分化培养液继续培养7天；含50% hMVECs条件液的ESCs分化培养液共培养8天；用10-7摩尔/升ICA与50% hMVECs条件液诱导24小时，再用50% hMVECs条件液的ESCs分化培养液共培养7天。对诱导后细胞采用免疫细胞及RT-PCR方法进行鉴定。

4.免疫细胞方法鉴定。鉴定诱导细胞中cTnT表达，以cTnT阳性细胞的个数算出分化率。4%多聚甲醛固定30分钟，其余步骤按SP试剂盒及DAB试剂盒进行。在倒置显微镜100倍视野下，每孔取4个视野，分化率即为棕黄色阳性细胞数和总细胞数的比值。

5.RT-PCR方法鉴定。通过RT-PCR鉴定诱导细胞中MLC-2v、α-M H C、β-M H C、N k x 2.5、GATA-4的表达。用Tranzol裂解细胞，提取总RNA。取1微克mRNA用于反转录反应。第一链cDNA合成及RT-PCR的反应条件与步骤分别按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix和2×EasyTaq PCR SuperMix进行。引物序列引自淫羊藿苷诱导mESCs分化为心肌样细胞的研究。

6.数据处理。用SPSS16.0（One-Way ANOVO）对分化率分析，数值为均值±标准差。

二、结果

1.免疫细胞染色及分化率统计。

表1 各组分化率比较

诱导8天后，对细胞进行免疫细胞染色，对照组未有阳性细胞，各试验组均有阳性细胞出现（图1）。由表1可见，分化率ICA和联合诱导组极显著高于50%hMVECs条件液组（P＜0.01），但ICA与联合诱导组间无显著性差异（P＞0.05），以联合诱导组效果最好（44.93%）。

2.诱导后细胞M L C-2 v、α-MHC、β-MHC、Nkx2.5、GATA-4基因的表达。各基因在诱导细胞中的表达见图2。由图2的B图可见有基因5种基因表达。而图2的A图空白对照组未观察到任何条带，即未有上述基因表达。

◎图2 基因诱导后细胞中的表达

三、讨论

ICA可改善患者心血管系统功能并对心脑血管具有良好保护作用，可降低心脏指数、缩小心肌梗死面积、降低心肌酶活性、对心脏缺血再灌注损伤也有一定的保护作用。微血管内皮可分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、前列腺素（PGs）、血栓素A2（TXA2）、一氧化氮（NO ）、内皮素（ET） 、白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6 （IL-6）、E-选择素（E-selectin）、P-选择素（P-selectin）等。Miwako等的研究中，在ESCs向心肌细胞分化过程中，外源性内皮细胞可刺激ESCs分化为心肌细胞，并能增加心肌细胞数量，极具有潜在的临床应用价值。石静宝等用间充质干细胞与内皮祖细胞共培养，可加速心肌组织形成并可促进血管网络化的构建。

有研究表明VEGF可抑制心肌细胞凋亡，并且新西兰兔骨髓间充质干经细胞腺病毒介导的肝细胞生长因子和VEGF双基因转染，之后移植可影响新西兰兔梗死心肌组织的修复重建及血管再生。ET-1不仅能促心肌样细胞肥大及成熟，也可促干细胞分化为心肌细胞，林永青等用Vit-C与ET-1联合，可使获得心肌细胞进一步纯化。NO或外源性NO可促进小鼠ESCs分化成心肌样细胞。本实验在ESCs分化培养体系中添加ICA、hMVECs条件液，二者联合使其向心肌样细胞分化，从免疫细胞染色结果阚，诱导后有cTnT的表达。通过对分化率较低hMVECs条件液组别中，对5种心肌特异性基因进行检测，进步证实了诱导后细胞具有心肌样细胞的特征。

通过ICA与hMVECs条件液联合诱导结果可见，心肌样细胞的分化率与ICA组无显著差异。ICA的生物活性非常强，对于多组织、器官、内分泌、心血管系统及抗肿瘤等方面都有重要作用。有研究，ICA参与了某些生物学和病理学过程，降低了心肌耗氧量及外周阻力，可明显改善心肌缺血和心律失常等疾病。也可上调HSP2，从而减少心肌缺血或再灌注损伤。ICA能促进大鼠海马神经干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖，并促进骨髓间充质干细胞分泌VEGF和bFGF，并随着时间的增加分泌量增加。ICA可上调NO信号通路有关的心脏转录因子如GATA-4、Nkx2.5mRNA、MLC-2v及α-MHC的表达，且呈现明显时效和量效性。ICA诱导ESCs分化为心肌样细胞效果优于hMVECs条件液，可能与促进细胞的分泌功能和上调NO信号通路相关因子的水平有关。hMVECs条件液中含有多种成分，每种因子又对心肌或心脏有直接或间接作用，但其诱导ESCs分化成心肌样细胞是一种还是多种因子互作的结果，其机制有待进一步探索。

◎图1 分化后细胞抗cTnT染色（×100）注：A：空白对照组；B：hMVECs条件液组；C：ICA组；D：二者联合组。

四、结论

本实验得出ICA和hMVECs条件液均可在体外诱导mESCs分化为心肌样细胞。用10-7摩尔/升ICA和50% hMVECs条件液联合诱导组效果最好，但二者联合未能显著提高心肌样细胞分化率，至于二者之间是否存在互作还需进一步研究。