不同提取方法对野木瓜膳食纤维提取及其抗氧化特性的影响研究

蒋 纬，王嘉莹，何 鸿

（1.遵义医药高等专科学校，贵州遵义 563006；2.遵义医学院，贵州遵义 563000）

正安野木瓜是贵州省遵义市正安县特色资源之一，野木瓜是木通科野木瓜属植物的干燥茎枝[1-3]，野木瓜中有多种活性成分，特别含有大量膳食纤维。近年来，营养相关疾病的高发，使得消费者逐渐增加了对营养平衡和合理膳食的关注，而膳食纤维的摄入可有效调节人体糖脂代谢，降低胆固醇含量，对预防高血压、心梗、糖尿病、便秘和结肠癌等都具有较好的功效。目前，国内对蔷薇科木瓜属木瓜抗氧化活性有研究[4-6]，也有以番木瓜科番木瓜抗氧化活性开展的研究[7-9]，鲜有通过微波法、超声碱法、双酶法、酸碱法、超声酶法5种方法对比野木瓜提取率的报道，也尚未见到野木瓜膳食纤维抗氧化特性的相关研究。试验以正安野木瓜为原料，用不同方法提取野木瓜膳食纤维，并研究了其对体外抗氧化特性的影响，以期为野木瓜膳食纤维的有效成分的资源化利用、提升提高野木瓜的附加值，开发野木瓜膳食纤维功能性食品提供科学依据，同时为后续有关野木瓜的深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

野木瓜，购自遵义市正安县；α-淀粉酶5 000 U/g，上海源叶生物有限公司提供；木瓜蛋白酶（80×104U/g），北京索莱宝生物有限公司提供；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、过氧化氢、硫酸亚铁、铁氰化钾、六水合三氯化铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、水杨酸等，均为分析纯；DPPH（1,1二苯基-2-苦基肼），上海化成工业发展有限公司提供。

1.2 试验仪器

恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司产品；低速离心机，东旺仪器厂产品；TG18-WS型台式高速离心机，长沙维尔湘鹰离心机有限公司产品；BPG-9140A型精密鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；FA2004N型电子天平，上海菁海仪器有限公司产品；SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵，北京泰和格润仪器有限公司产品；P70D20N1P-G5（SO）型格兰仕微波炉，广东格兰仕微波炉电器制造有限公司产品；DFY-200C型万能粉碎机、BL13-300H型数控超声波清洗器，上海比朗仪器有限公司产品；PHS-3C型酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；玻璃棒，烧杯，移液管等玻璃仪器若干。

1.3 试验方法

1.3.1 野木瓜粉末的制备

将野木瓜切片后于60℃热风干燥箱中烘干，粉碎机粉碎60目过筛收集作为原料备用。

1.3.2 野木瓜膳食纤维的制备

（1）酸碱法。采用李慧芸等人[10]的方法并略做改动。取20 g原料按照料液比1∶25（g∶mL） 加入浓度1 mol/L的HCI溶液，用浓度10 mol/L的NaOH调节pH值1.0，在80℃下水解90 min，得到酸解液，随后进行离心处理，离心后取上清液，抽滤后得滤饼，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入质量分数1.4%NaOH溶液，在75℃条件下碱解80 min，离心后得上清液和下沉淀，其中沉淀进行干燥后便为IDF，上清液进行抽滤后再经过4倍体积的无水乙醇醇沉2 h，以转速3 500 r/min离心20 min，沉淀干燥至恒质量即为SDF。

（2） 双酶法。采用贾玮等人[7]的方法。取原料20.0 g按照料液比1∶20（g∶mL） 加入蒸馏水，用浓度1.0 mol/L的HCl和NaOH调节pH值6.0，先加400 μL酶活力为5 000 U/g的α-淀粉酶，在60℃下，酶解35 min，升温至100℃，灭酶活10 min后冷却，再调节pH值6.0，加400 μL酶活力为8 000 U/g的木瓜蛋白酶，在40℃条件下酶解35 min，升温至100℃，灭酶活10 min，将酶解好的溶液进行离心，离心后沉淀直接干燥为IDF，上清液抽滤后用4倍体积的无水乙醇进行醇沉后，以转速3 500 r/min离心20 min，离心后弃去上清液，沉淀干燥至恒质量即为SDF。

（3） 微波辅助法。参照罗欢[11]的方法。取原料20.0 g，按照料液比1∶28（g∶mL） 加入蒸馏水，用浓度1 mol/L HCI溶液和NaOH溶液调节pH值2，然后进行功率为560 W微波处理，微波时间为135 s，将提取液进行离心处理，离心后的沉淀直接进行干燥得IDF，上清液抽滤后用4倍体积的无水乙醇醇沉1 h，以转速3 500 r/min离心20 min，沉淀干燥既得SDF。

（4） 超声辅助碱法。参照罗欢[11]的方法略有改动。取原料20.0 g，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入质量分数为4%的NaOH溶液，在功率120 W，温度55℃条件下处理80 min，将处理后的原液进行离心，沉淀直接干燥即为IDF，上清液抽滤后用4倍体积的无水乙醇醇沉2 h后，以转速3 500 r/min离心20 min，离心后的沉淀直接进行干燥，得到SDF。

（5） 超声波辅助酶法。称取20 g原料，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入蒸馏水，用浓度1.0 mol/L的HCI和NaOH调节pH值6.0，加200 μL酶活力5 000 U/g的木瓜蛋白酶，在温度40℃、功率120 W条件下超声波辅助酶解35 min，后升温至100℃，灭酶活10 min，将酶解好的溶液进行离心，离心后沉淀直接干燥为IDF，上清液抽滤后用4倍体积的无水乙醇进行醇沉2 h后，以转速3 500 r/min离心20 min，离心后弃去上清液，沉淀干燥，得到SDF。

1.3.3 抗氧化活性成分的提取

参考周小理等人[12]的研究方法，并略有改动。分别称量提取的野木瓜膳食纤维SDF和IDF各2 g，用70%的乙醇溶液，按照料液比1∶50（g∶mL） 加入，于70℃恒温水浴中浸提5 h，并以转速3 000 r/min离心10 min，取上清液作为样品液备用。

1.3.4 抗氧化活性成分的测定

（1） 总还原能力的测定。准确量取2.5 mL样品液，加入2.5 mL的浓度为0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾，于50℃下水浴20 min后急速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，后取5 mL反应液，加入4 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，将溶液均匀混合后反应10 min，于波长700 nm处测定其吸光度[13]。

（2）DPPH自由基清除率的测定。参照石秀梅等人[14]的研究方法，准确称取DPPH用无水乙醇配成储备液（1.0×10-3mol/L）保存于冰箱中冷藏备用，使用时再将其稀释10倍。取1.0 mL的1.0×10-4mol/L（DPPH-乙醇溶液）与3.0 mL样品溶液混匀，在避光常温条件下反应30 min后，于波长517 nm处测定其吸光度。

按照下式计算DPPH自由基清除率：

式中：A1——样品溶液；

A2——取1.0 mL体积分数为50%的乙醇溶液与3.0 mL的样品液混合，在避光常温条件下静置30 min，得样品对照组A2，于波长517 nm处测定吸光度；

A0——取1.0 mL的DPPH-乙醇溶液与3.0 mL的蒸馏水混合，在避光常温条件下静置30 min，于波长517 nm处测定其吸光度。

（3） 羟自由基清除能力测定。采用Fenton反应体系模型，先取1 mL样品液稀释15倍，依次加入浓度为6 mmol/L水杨酸乙醇溶液2.0 mL，浓度为6 mmol/L硫酸亚铁2.0 mL，1.0 mL稀释的样品液，再加入浓度为6 mmol/L过氧化氢溶液0.1 mL，在37℃恒温条件下反应30 min，于波长510 nm处测定吸光度。

按照下式计算羟自由基清除率：

式中：A1——样品溶液；

A2——样品对照组：用蒸馏水将加入H2O2步骤替换，其他不变；

A0——模型对照组：用蒸馏水作为样品液，其他不变。

1.4 统计分析

试验数据平行测定3次，测定平均值，采用Origin 2017软件作图，应用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，差异显著性水平为p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对野木瓜膳食纤维提取率及色泽的影响

不同提取方法对野木瓜膳食纤维提取率及色泽的影响表1。

表1 不同提取方法对野木瓜膳食纤维提取率及色泽的影响

由表1可知，经超声辅助碱法提取野木瓜果皮渣IDF提取率最高，可达到59.87%，其次是双酶法、超声波辅助酶法、微波法分别为53.06%，52.78%，52.64%，3种方法提取率无显著性差异（p＞0.05），酸碱法IDF提取率最低为46.15%；超声辅助碱法的SDF的提取率最低为1.87%，超声波辅助酶法的提取率最高可达到4.13%，双酶法和酸碱法的SDF提取率为3.6%和3.37%。通过对所提取的IDF的色泽进行感觉评价，酸碱法和超声波辅助碱法所提取的IDF和SDF颜色较深分别为黑紫色和黑褐色，而其余的3种方法提取的IDF黄色或浅黄色。酸、碱处理虽然都可以不同程度地提高样品的得率，但处理后的样品颜色变深，反复调整pH值必将引进大量的阴阳离子，给下一步的食品加工带来不便，通过对比分析，由于酸碱法和超声波-碱法所提取的IDF和SDF颜色较深，不利于后期的抗氧化活性成分的测定中显色试验的开展，也不利于后期食品加工的研究[15]。因此，酸碱法和超声辅助碱法所提取的IDF和SDF不再进行抗氧化活性成分的测定。

2.2 不同提取方法对野木瓜膳食纤维还原能力的影响

还原能力的测定是以样品是否为良好的电子供体为指标，还原能力大的样品是良好的电子供体，其供应的电子不仅能使Fe3+还原成Fe2+，同时能与自由基反应，使自由基成为较为稳定的物质，从而中断自由基连锁反应[16]。

不同提取方法对野木瓜膳食纤维还原能力的影响见图1。

图1 不同提取方法对野木瓜膳食纤维还原能力的影响

由图1可知，微波法、双酶法、超声波辅助酶法3种方法中，双酶法提取的SDF还原能力最高，吸光度达到了1.419，微波法和超声酶法次之，分别为1.399和1.397，3种方法提取的SDF还原能力无显著性差异（p＞0.05）；对于IDF，微波法和超声酶法提取的IDF还原能力较高吸光度分别为1.41和1.40，双酶法提取的IDF还原能力最低吸光度为1.389，3种方法提取的IDF还原能力差异不显著性（p＞0.05）。

2.3 不同提取方法对野木瓜膳食纤维DPPH自由基清除率的影响

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，被广泛用于测定样品对自由基的清除能力，DPPH自由基乙醇溶液为深紫色，于波长517 nm附近有强吸收峰，DPPH自由基接受受试物的电子而变成稳定的抗磁分子，溶液颜色变浅呈黄色，吸光度变小[17]。

不同提取方法对野木瓜膳食纤维DPPH自由基清除率的影响见图2。

由图2可知，各种方法提取的野木瓜膳食纤维清除DPPH自由基的能力中微波法提取IDF清除能力最高，达到24.19%，超声波辅助酶法提取IDF清除能力次之为17.74%，二者差异显著（p＜0.05）。微波法和双酶法提取SDF的DPPH自由基清除能力一样，都达到12.9%，超声波辅助酶法的最低清除能力为9.68%。

图2 不同提取方法对野木瓜膳食纤维DPPH自由基清除率的影响

2.4 不同提取方法对野木瓜膳食纤维羟自由基清除率的影响

羟自由基是毒性最强的活性氧，可直接损坏生物膜，可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损伤，大量产生是中毒的重要特征，因此清除羟自由基是预防各种疾病的有效途径[18]。

不同提取方法对野木瓜膳食纤维羟自由基清除率的影响见图3。

图3 不同提取方法对野木瓜膳食纤维羟自由基清除率的影响

由图3可知，超声酶法提取的IDF羟自由基清除率最高为14.96%，微波法提取的SDF羟自由基清除率最高为20.6%，不同提取方法得到的同种膳食纤维羟自由基清除率之间均存在显著差异性（p＜0.05）。

3 结论

利用微波法、超声波辅助碱法、双酶法、酸碱法、超声波辅助酶法5种方法提取野木瓜SDF和IDF，通过测定还原能力、羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力，研究了野木瓜SDF和IDF抗氧化特性和还原能力，确定了酸碱法和超声辅助碱法所提取的野木瓜IDF和SDF不宜用于抗氧化活性成分的测定，可对这2种方法所提取的野木瓜IDF和SDF进行适当的脱色处理后再进行后续的抗氧化活性测定，但脱色处理在一定程度上可能会影响抗氧化性。微波法、双酶法、超声波辅助酶法3种方法所提取的野木瓜SDF和IDF表现出了不同的抗氧化能力，说明不同提取方法会对野木瓜中的IDF活性产生影响，综合各因素考虑，微波法所提取的野木瓜IDF和SDF能够较好保持其还原能力和抗氧化能力，相较其他方法，从提取时长、能耗、成本等方面都充分体现了其优势，在下一步的研究中拟重点优化微波法的提取工艺，以期得到高提取量、高抗氧化性的野木瓜IDF和SDF，为利用地方特色资源生产抗衰老保健品和开发功能性食品基料添加物提供基础数据和理论支撑。