SOX7启动子甲基化对膀胱癌增殖及凋亡的影响

吴 元，张文涛，马文超，王瑞良，郭亚东，刘 济，毛士玉，张俊峰，姚旭东

0 引 言

膀胱癌是最常见的泌尿系恶性肿瘤之一，全球范围内在新发恶性肿瘤中居第10位，在男性新发恶性肿瘤中居第6位，在男性肿瘤死亡率中居第9位［1］。临床中70%～75%的新发膀胱癌为非肌层浸润性，经尿道膀胱肿瘤电切术辅助术后膀胱灌注化疗为其主要治疗方案，然而该类患者5年复发率高达50%～70%，且有10%～15%会进展为肌层浸润性膀胱癌。肌层浸润性膀胱癌约占每年新发膀胱癌的25%左右，其5年肿瘤特异性生存率仅50%左右［2，3］。因此筛选新的膀胱肿瘤生物学标志物，对膀胱癌预防，诊断及治疗有重要意义。

DNA启动子甲基化异常是表观遗传学改变重要形式之一，与膀胱肿瘤的发生，发展有密切关系［4］。SOX7是SOX家族之一，参与多种发育过程，包括造血［5］、心血管生成［6］、内胚层分化［7］、肌卫星细胞生成［8］等。最近研究表明其在肾癌［9］、肺癌［10］、乳腺癌［11］、前列腺癌［12］等作为转录因子发挥抑癌作用，并受到启动子甲基化的调控。在膀胱癌中SOX7发挥的作用具体机制仍不明确。本研究采用甲基化特异性PCR技术检测膀胱癌患者尿中SOX7基因甲基化情况，并研究去甲基化药物5-氮杂-2′脱氧胞苷（5-aza-dc）对膀胱癌细胞系的影响。

1 资料与方法

1.1数据库分析GEPIA数据库分析TCGA和GTEx项目中的9736个肿瘤和8587个正常样本的RNA测序表达数据。包含33种恶性肿瘤。用于分析寻找肿瘤组织和正常组织中差异表达的基因，本研究中选择使用TCGA数据库。Oncomine数据库收集729个基因数据集，90000多个癌症组织和正常组织的样本数据。本研究中设置的检索条件：①Analysis type：“carcinoma vs normal analysis”；②设定条件：“Under-expression”。从Oncomine数据库中筛选基因，选择SOX7基因后，设定条件为：“Gene SOX7”，余条件同前。

MethHC数据库包括18个人类癌症、6548个芯片和12 567个RNA的超过6000个样本的测序数据。在MethHC数据库中，选择“BLCA”，在“gene search”中输入“SOX7”，在“gene region”中选择“promoter”（https：//methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）。cBioPortal（http：//www.cbioportal.org）整合了126个肿瘤基因组研究的数据，涵盖了28 000例标本数据，此外部分样品还包括临床预后的信息。在网站中选择“bladder cancer”，“TCGA”，“tumor sample with methylation data”，“SOX7”，在结果中选择“survival”。

1.2临床资料收集2017年1月至10月在上海市第十人民医院泌尿外科40份尿液标本。其中膀胱癌患者20例，正常对照20例。新鲜的尿液标本立即在液氮中迅速冷冻，保存于-80℃。本研究获得上海市第十人民医院伦理委员会批准（批准号：2019-k-113），患者均签署知情同意书。

1.3细胞及试剂人膀胱癌移行细胞株（T24，UMUC3，J82，5637）及人永生化尿路上皮细胞（SVHUC-1）均购自中科院上海细胞库。RPMI-1640培养基、DMEM培养基、转染试剂Lipifectin3000购自美国life technologies公司。胎牛血清购自美国Gemini公司。甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'脱氧胞苷（5-aza-2'deoxycytidine，5-aza-dc）购自美国Sigma公司。CCK-8试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。SOX7抗体购自美国R&D公司，ACTIN，GAPDH，Bcl2、Bax、Cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白，羊抗兔二抗，驴抗羊二抗均购自美国Abcam。

1.4方法

1.4.1患者尿液甲基化特异性PCR 取50 mL尿液，4℃、3000转/min，离心15 min，留沉淀弃上清用DNA提取。运用自动核酸提取仪采用磁珠法进行核酸提取，经裂解与亚硫酸氢盐的转化并纯化。用甲基化特异性PCR进行扩增，最后将扩增出的产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的结果分析目的基因甲基化状态。甲基化引物序列：F，5'-GTTTTGGACGTCGAGTTGTC-3'，R，5'-AACC-CAAACCATAAAAACGTT-3'。非甲基化引物：F，5'-GGTTTTGGATGTTGAGTTGTTG-3'R，5'-CTTAACCCAA-ACCATAAAAACATT-3'。PCR反应条件：95℃，预变性10 min，1个循环；94℃，变性，45 s，53℃（甲基化）/57℃（非甲基化），退火45 s，72℃，延伸45 s，共35个循环；72℃再延伸10 min。

1.4.2膀胱癌细胞系培养及5-aza-da处理用含有10%胎牛血清、双抗的RPMI-1640培养基进行培养及传代，在6孔板上进行铺板。细胞密度达到30%～40%，5-aza-dc组T24细胞中加入含有5-aza-dc的培养基，使其药物浓度分别为10、20 μmol/L，对照组T24细胞加入同体积的DMSO。连续处理3 d，每天更换新鲜配置的药物。

1.4.3膀胱癌细胞系转染SOX7质粒膀胱癌细胞在6孔板上铺板，当细胞密度达30%～40%，按照转染试剂Lipifectin3000说明书进行操作，转染SOX7质粒（Ubiquitin 3FLAG GFP IRES-Puromycin，购自上海吉凯基因公司）为质粒组，转染空载质粒为空载组。

1.4.4 Western blot 每孔加入60 μg蛋白样品，电泳后湿转至PVDF膜中，5%脱脂奶粉封闭60 min，4℃冰箱中孵育一抗16～20 h，TBST洗涤5次，二抗孵育60 min，显影曝光。

1.4.5 CCK8实验采用CCK-8试剂检测细胞的增殖速率。在96孔板上以每孔1000个细胞的密度接种，细胞贴壁后，用5-aza-dc连续处理5 d，每天更换新鲜配置的药物。每孔加入10 μL的CCK-8试剂，37℃培养箱孵育2 h，2 h后用酶标仪测量450 nm的吸光度。

1.4.6平板克隆实验采用平板克隆实验检测细胞的增殖活性。在6孔板上铺板，每孔细胞数量为1000个。细胞贴壁后，每天更换含有5-aza-dc药物的培养基。当培养7～10 d，6孔板中肉眼可见克隆形成时，停止培养。

1.4.7细胞凋亡实验在6孔板上铺板，当细胞密度达30%～40%时，更换含有5-aza-dc培养基，连续处理5 d，当细胞密度达90%～95%，用胰蛋白酶消化，转移至流式管中，加入400 μL的结合缓冲液混匀后，与PI和Annexin V-FITC反应后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据库中的Kaplan-Meie曲线采用Log Rank法分析，计量数据以均数±标准差（xˉ±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法；计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SOX7在数据库中的表达情况TCGA数据库和Oncomine数据库中可以发现SOX7在膀胱癌中的表达下调，见图1。MethHC数据库中，SOX7有1个转录本（NM_031439），其在膀胱癌组织中甲基化水平明显高于正常组织（P＜0.005）。通过cBioPortal结果可得，SOX7高甲基化的患者无进展生存期较低甲基化患者明显降低（P＜0.05）。见图2。

2.2 SOX7在膀胱癌患者的尿液中甲基化水平膀胱癌患者尿液中15例（75%）SOX7甲基化水平增高，而正常人尿液中仅7例（35%），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 SOX7基因在不同膀胱癌细胞株中的表达Western blot结果显示，与SV-HUC-1细胞株相比，SOX7蛋白在T24、UMUC3、J82、5637细胞株中表达均显著降低（P＜0.05）。见图3。实验细胞株选择T24细胞。

图1 SOX7基因在数据库中的表达情况Figure 1 The expression of SOX7 gene in database

图2 数据库中膀胱癌SOX7基因甲基化及预后情况Figure 2 Methylation and prognosis of bladder cancer SOX7 gene in the database

图3 SOX7基因在膀胱癌中的表达情况Figure 3 SOX7 gene expression in bladder cancer cell lines

2.4过表达SOX7质粒及5-aza-dc处理后SOX7蛋白的表达上调5-aza-dc组SOX7蛋白的表达量较对照组上调，当浓度达到20 μmol/L时，SOX7蛋白表达量相对较高。因此选择5-aza-dc的浓度为20 μmol/L为后续实验浓度。质粒组SOX7蛋白表达量较空载组上调明显，见图4。

图4 5-aza-dc及转染质粒后SOX7的表达Figure 4 SOX7 expression increased after 5-aza-dc treatment and after plasmid transfection

2.5过表达SOX7质粒及5-aza-dc处理后T24细胞的增殖能力CCK-8结果显示，第5天，5-aza-dc组A值较对照组显著降低（P＜0.05）；质粒组A值较空载组明显降低（P＜0.05）。克隆形成实验发现，5-azadc组每孔克隆形成数［（167.33±13.65）个］较对照组［（328.00±20.81）个］明显下降（P＜0.05）。质粒组每孔克隆形成数［（136.00±15.00）个］较空载组［（280.67±13.43）个］明显下降（P＜0.05）。见图5。

图5 5-aza-dc处理和转染质粒后T24细胞的增殖能力Figure 5 The ability of cell proliferation decreased after 5-aza-dc treatment and plasmid transfection

2.6过表达SOX7质粒及5-aza-dc处理T24细胞的凋亡流式细胞仪凋亡实验发现，5-aza-dc组T24细胞的凋亡率（27.89%）较对照组（3.79%）明显升高（P＜0.05）；质粒组细胞凋亡率（21.28%）较空载组（9.90%）明显增高（P＜0.05）。见图6。 Western blot结果显示，与对照组比较，5-aza-dc组Bcl2蛋白表达明显下调，Bax、Cleaved Caspase-3表达上调明显。质粒组Bcl2蛋白较空载组表达明显下调，Bax、Cleaved Caspase-3表达上调明显。见图7。

图6 5-aza-dc处理和转染质粒后细胞凋亡情况Figure 6 Apoptosis after 5-aza-dc treatment and plasmid transfection

图7 5-aza-dc处理和转染质粒后凋亡蛋白表达情况Figure 7 Expression of apoptotic proteins after 5-aza-dc treatment and transfection of plasmids

3 讨 论

本研究中，通过数据库验证了膀胱癌中SOX7基因高甲基化，SOX7基因低表达，并且SOX7基因高甲基化可能影响膀胱癌的预后。而通过40例尿液检测，验证了在膀胱癌中SOX7基因甲基化水平高表达，膀胱癌细胞系蛋白Western blot检测结果表明SOX7基因在膀胱癌中低表达。Bca细胞中SOX7基因的高甲基化状态可被5-aza-dc诱导去甲基化。通过Western blot实验可以验证当5-aza-dc浓度达到20 μmol/L时，SOX7蛋白表达量显著上调，通过CCK-8实验，平板克隆实验，流式细胞仪检测细胞凋亡实验验证了SOX7基因高甲基化被逆转后，SOX7蛋白表达升高后，抑制了膀胱癌细胞的增殖，促进了膀胱癌细胞的凋亡。同时通过转染过表达SOX7质粒，进一步证明SOX7的高表达与膀胱癌细胞的增殖和凋亡相关。由此我们可以得出SOX7基因在膀胱癌中发挥重要作用，而其启动子区域高甲基化可能是其表达沉默的机制之一。

DNA甲基化是表观遗传学修饰的重要形式之一，其主要表现为富含CPG岛的启动子区域甲基化，通过启动子区域的甲基化阻碍启动子与转录因子相结合，从而阻碍基因的转录或转录水平下降［13］。研究表明，SOX7基因在多种肿瘤中的表达水平与基因的启动子甲基化水平相关。Wang等［9］报道在肾透明细胞癌中，SOX7基因的表达受其启动子甲基化水平调控，并通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。Kostroma等14］报道在急性髓系白血病SOX7通过启动子甲基化与Wnt/β-catenin信号通路发生拮抗作用。Xu等15］报道SOX7甲基化对骨髓异常增生综合征的预后不良，并且与白血病的进展相关。而SOX7基因在膀胱癌中的表达及启动子甲基化情况报道较少。本研究首次通过大样本基因数据库，患者尿液标本，膀胱癌细胞系从不同角度阐述了SOX7及其甲基化状态对膀胱癌的影响。

DNA甲基化作为肿瘤的发生发展过程中非常重要的进程［16-17］。因此，基因甲基化状态可能作为一个重要的诊断标志物。膀胱作为储尿器官，通过检测尿液中基因的甲基化水平能一定程度上反应膀胱的状态。有研究通过检查尿液的一些基因的甲基化状态，如 BCL2，CDKN2A，NID2，TWIST1，GDF15，TMEFF2等，可以用于早期诊断膀胱癌，且敏感性高于尿脱落细胞学［18-20］。另有研究证实通过检测一组基因的启动子CPG岛甲基化状态，可以作为膀胱癌进展的预后的生物学标志物［21-22］。因此，SOX7启动子甲基化可能是膀胱癌的诊断和预后的潜在标志物。

细胞中存在不同状态甲基化DNA，如在TPC1细胞株中CITED1基因［23］，通过改变基因启动子甲基化的程度，进而影响基因的表达，因此，在膀胱癌或癌前病变时通过去甲基化处理，很有可能对膀胱癌的治疗及预防发挥积极的作用。5-aza-dc作为一种去甲基化药物，已有用于肿瘤治疗的研究［24］，在膀胱癌中是否发挥作用及其具体机制仍需进一步研究。

综上所述，本研究结果显示SOX7在膀胱癌低表达，其表达受启动子甲基化调控，是膀胱癌的潜在生物学标志，在膀胱癌的发生、发展中发挥重要作用。本研究还存在不足：样本偏少，没有患者的随访资料，另外SOX7在膀胱癌中的调控机制不明，因此需进一步的探讨SOX7在膀胱癌中的调控机制。