转化生长因子β1通过赖氨酰氧化酶调控低氧诱导的大鼠支气管上皮细胞间充质转化*

夏晓东, 彭燕平， 雷 丹， 陈伟谦

(温州医科大学附属第二医院&育英儿童医院呼吸内科， 浙江 温州 325027)

气道结构重建是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和支气管哮喘等众多呼吸系统疾病病理改变的关键环节，涉及到气道上皮完整性破坏、细胞外基质沉积、平滑肌细胞增生和气道壁增厚等[1]。尽管气道结构重建的机制复杂且未明，但目前认为支气管上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在其中起着重要作用。支气管上皮细胞EMT包括间充质细胞表型向肌成纤维细胞转变以及细胞外基质的过度合成。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作为低氧和炎症反应的关键调节器，参与支气管上皮细胞EMT进程的调控[2]。研究报道，COPD及支气管哮喘患者TGF-β1合成增多，是其支气管上皮细胞EMT进程的强劲助推剂[3-4]。赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)作为一种铜依赖的胺氧化酶，通过媒介弹性蛋白和胶原蛋白基质交联，促进细胞外基质的形成及沉积，同样能调控EMT。我们以往研究曾报道，低氧能诱导肺动脉平滑肌细胞以及支气管上皮细胞LOX的表达，具体机制尚未阐明[5]。有意义的是，对人成纤维细胞的研究显示TGF-β1能诱导LOX的表达[6]。为此，我们通过建立低氧大鼠动物模型和离体培养大鼠支气管上皮细胞，分别给予TGF-β1、TGF-β1受体拮抗剂SB431542及LOX抑制剂β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，β-APN)进行干预，探讨TGF-β1是否通过激活LOX参与低氧诱导的支气管上皮的EMT进程。

材 料 和 方 法

1 主要材料和试剂

大鼠支气管上皮细胞购自ScienCell。DMEM培养基、特级胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco；SB431542和β-APN购自Sigma-Aldrich；Sircol胶原测定及羟脯氨酸比色法试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠TGF-β1、E钙黏蛋白(E-cadhe-rin)以及波型蛋白(vimentin)、LOX以及β-actin多克隆抗体购自Abcam；二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。二氧化碳培养箱购自ThermoForma；Biosens SC620凝胶成像系统购自上海生物科技公司；全自动倒置显微镜购自Zeiss。

2 方法

2.1低氧大鼠动物模型的建立 从温州医科大学动物实验中心获得24只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重200～250 g)。将大鼠随机均分为常氧对照(control)组、低氧(hypoxia)组及低氧+β-APN(hypoxia+β-APN)组。常氧对照组大鼠置于室温常压饲养舱，舱内O2浓度维持于21%。低氧组大鼠置于低氧常压氧舱，舱内O2浓度维持于(10±0.5)%，CO2浓度为<2%，每天8 h，每周干预6 d，分别饲养3周；低氧+β-APN组大鼠腹腔注射100 mg/kg β-APN后同样置于低氧舱；其余时间与常氧对照组同样条件下处于同一室内呼吸空气，室温为(20～25)℃，相对湿度为50%～60%。

2.2细胞培养 在体外细胞培养研究中，大鼠原代支气管上皮细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养接种。待细胞长到80%融合后进行传代，使用生长良好的3～5代细胞进行离体实验。将培养的支气管上皮细胞分为常氧对照组、TGF-β1组(分别孵育不同浓度：0.1、1、5及10 μg/L)、TGF-β1+ SB431542(5 μmol/L)组、低氧组、低氧+SB431542组以及低氧+β-APN组。常氧组、TGF-β1组及TGF-β1+SB431542组置于37 ℃、5% CO2及21% O2培养箱培养48 h，低氧组、低氧+SB431542组及低氧+β-APN组置于37℃、5% CO2及3% O2环境培养48 h。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

2.3胶原蛋白含量及交联的测定 取100 mg肺组织或细胞培养液以含0.5 mmol/L乙酸的5 g/L胃蛋白酶消化并抽提过夜。胃蛋白酶能消化的胶原蛋白为可溶性(非交联)胶原蛋白，而胃蛋白酶不能消化的称之为不可溶性(交联)胶原蛋白。抽提液经4 ℃ 2 100×g离心6 min后，分离出可溶性及不可溶性胶原蛋白。Bradford法进行蛋白定量。Sircol胶原试剂盒测定可溶性胶原蛋白的含量，羟脯氨酸比色法测定可溶性及不可溶性胶原蛋白的总含量。具体按说明书操作。不可溶性胶原蛋白含量=总的可溶性及不可溶性胶原蛋白含量-可溶性胶原蛋白含量。胶原交联=不可溶性胶原蛋白/可溶性胶原蛋白。

2.4免疫组织化学检测支气管上皮细胞LOX及EMT标记物蛋白 取5 mm×5 mm×5 mm大小的肺组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片。依次经脱蜡脱水后至水，3% H2O2-甲醇室温处理，0.01 mmol/L枸橼酸盐缓冲液中进行抗原修复。10%羊血清37 ℃封闭15 min，1 ∶200兔抗大鼠LOX、E-cadherin和vimentin多克隆抗体37 ℃孵育1 h(用正常兔血清进行阴性对照实验)，1 ∶100生物素化羊抗兔抗体37 ℃孵育10 min，1 ∶100辣根酶标记链酶卵白素37 ℃孵育10 min后，DAB显色5～10 min，水洗，苏木素复染，透明，梯度乙醇脱水，封片，镜检。棕黄色显色为LOX、E-cadherin或vimentin阳性表达。定性分析切片支气管上皮细胞的染色。

2.5Western blot检测支气管上皮细胞LOX及EMT标记物蛋白 提取细胞总蛋白，12 000×g离心15 min，收集上清。Bradford法测定匀浆总蛋白浓度。12% SDS-PAGE分离蛋白，应用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转入硝酸纤维素膜，3%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别用1 ∶400的抗LOX、E-cadherin或vimentin 抗体4 °C孵育过夜，以1 ∶500的抗β-actin多克隆抗体作内参照，辣根过氧化物酶标记的 II 抗室温反应2 h，DAB显色后摄像扫描分析蛋白电泳条带相对光吸光度(A)值。

3 统计学处理

采用SigmaPlot软件进行统计分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。两样本均数的比较采用t检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析Student-Newman-Keuls(SNK)法，各组均数进行两两比较采用Bonferronit检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 低氧状态下大鼠支气管上皮细胞TGF-β1及LOX表达的变化

免疫组化结果显示，常氧对照组大鼠支气管上皮细胞TGF-β1以及LOX蛋白表达均较弱，呈弱或无棕黄色免疫反应显色，低氧组大鼠支气管上皮细胞TGF-β1以及LOX表达蛋白均明显增强，呈强棕黄色免疫反应显色，见图1。

Figure 1.The effect of hypoxia on the protein expression of LOX and TGF-β1 in the rat bronchial epithelial cells detected by immunohistochemistry (×200).

2 低氧及β-APN对大鼠支气管上皮细胞EMT相关标志物E-cadherin和vimentin表达的影响

免疫组化结果显示，常氧对照组大鼠支气管上皮细胞相关标志物E-cadherin呈强棕黄色阳性表达；低氧组大鼠支气管上皮细胞E-cadherin表达明显减弱，呈弱棕黄色免疫反应显色；给予β-APN处理的低氧组大鼠支气管上皮细胞E-cadherin表达明显增强，呈强棕黄色免疫反应显色。常氧对照组大鼠支气管上皮细胞相关标志物vimentin呈弱棕黄色弱阳性；低氧组大鼠支气管上皮细胞vimentin表达明显增强，呈强棕黄色免疫反应显色；给予β-APN处理的低氧组大鼠支气管上皮细胞vimentin表达明显减弱，呈弱棕黄色免疫反应显色，见图2。

Figure 2.The effect of β-APN on the protein expression of E-cadherin and vimentin in hypoxia-exposed rat bronchial epithelial cells detected by immunohistochemistry (×200).

Western blot检测结果显示，低氧组离体培养的大鼠支气管上皮细胞E-cadherin表达较常氧对照组显著减少(P<0.01)。然而，低氧组离体培养的大鼠支气管上皮细胞vimentin表达较常氧对照组显著增多(P<0.01)。β-APN处理低氧离体培养的大鼠支气管上皮细胞后，不仅逆转低氧抑制的E-cadherin表达(P<0.05)，而且削弱低氧诱导的vimentin的表达(P<0.01)，见图3。

Figure 3.The effect of β-APN on the protein expression of E-cadherin and vimentin in hypoxia-exposed rat bronchial epithelial cells in vitro determined by Western blot. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs hypoxia group.

3 低氧、TGF-β1及β-APN对离体培养大鼠支气管上皮细胞形态学的影响

常氧对照组大鼠支气管上皮细胞为铺路石状形态，呈不规则多边形、细胞结合紧密。TGF-β1和低氧处理的大鼠支气管上皮细胞形态逐渐向梭形转化，细胞间结合松散；给予SB431542或β-APN处理低氧大鼠支气管上皮细胞，其细胞梭形转化形态减少，而铺路石状形态明显增多，见图4。

Figure 4.The effect of hypoxia, TGF-β1 and β-APN on the morphological changes of rat bronchial epithelial cells in vitro (×200).

4 低氧、TGF-β1及β-APN对大鼠肺组织及离体培养支气管上皮细胞的胶原含量和胶原交联的影响

低氧组大鼠肺组织胶原含量以及胶原交联均明显高于常氧对照组，β-APN组大鼠肺组织胶原含量以及胶原交联均明显低于低氧组(P<0.05)，见图5。

Figure 5.The effect of β-APN on the content and cross-linking of collagen in hypoxia-exposed rat lung tissue. Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs hypoxia group.

TGF-β1组和低氧离体培养的大鼠支气管上皮细胞胶原含量以及胶原交联均明显高于常氧对照组(P<0.01)。与低氧组相比，给予SB431542孵育处理后，低氧培养的大鼠支气管上皮细胞胶原含量以及胶原交联均明显降低(P<0.05)，见图6。

Figure 6.The effect of hypoxia and TGF-β1 on the content and cross-linking of collagen in rat bronchial epithelial cells in vitro. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs TGF-β1 group; △△ P<0.01 vs hypoxia group.

5 TGF-β1对常氧离体培养大鼠支气管上皮细胞LOX表达的影响

以不同浓度(0.1、1及10 μg/L)TGF-β1孵育常氧离体培育的大鼠支气管上皮细胞，观察TGF-β1对LOX表达的影响。Western blot检测显示，TGF-β1上调了大鼠支气管上皮细胞LOX蛋白的表达水平，随着TGF-β1孵育浓度的上升，LOX蛋白的表达逐渐增多，呈浓度依赖性增高趋势；各不同浓度组之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图7。TGF-β1(5 μg/L)对常氧离体培育大鼠支气管上皮细胞LOX表达的诱导作用则被添加的SB431542所抑制(P<0.01)，见图8。

Figure 7.The effect of TGF-β1 at different concentration on the protein expression of LOX in rat bronchial epithelial cells in vitro determined by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group; △P<0.05 vs 0.1 μg/L TGF-β1 group; # P<0.05 vs 1 μg/L TGF-β1 group.

6 TGF-β1及TGF-β1抑制剂对低氧离体培养支气管上皮细胞LOX表达的影响

与常氧对照组比较，TGF-β1组和低氧组离体培养大鼠支气管上皮细胞的LOX蛋白表达显著增多(P<0.01)；与TGF-β1组和低氧组相比较，给予SB431542孵育处理低氧培养的大鼠支气管上皮细胞后，LOX的表达水平明显下调(P<0.01)，见图8。

Figure 8. The effect of hypoxia and TGF-β1 on the protein expression of LOX in rat bronchial epithelial cells in vitro determined by Western blot. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs TGF-β1 group; △△ P<0.01 vs hypoxia group.

7 TGF-β1及TGF-β1抑制剂对低氧离体培养支气管上皮细胞EMT相关标志物E-cadherin及vimentin表达的影响

Western blot检测显示，与常氧对照组比较，TGF-β1孵育能明显降低常氧离体培育的大鼠支气管上皮细胞E-cadherin的表达(P<0.01)，同时TGF-β1孵育则增加常氧离体培育的大鼠支气管上皮细胞vimentin的表达(P<0.05)。添加SB431542能逆转TGF-β1孵育对常氧离体培育的大鼠支气管上皮细胞E-cadherin及vimentin表达的影响(P<0.05)。此外，SB431542处理低氧离体培养大鼠支气管上皮细胞后，其一方面能逆转低氧抑制的E-cadherin表达(P<0.01)，另一面则降低低氧诱导的vimentin表达(P<0.01)，见图9。

Figure 9. The effect of hypoxia and TGF-β1 on the protein expression of E-cadherin and vimentin in rat bronchial epithelial cells in vitro determined by Western blot. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group； ## P<0.01 vs TGF-β1 group； △△ P<0.01 vs hypoxia group.

讨 论

COPD及支气管哮喘由于其支气管和肺组织处于低氧状态或接触有害气体或过敏物质等因素易出现炎症反应，导致气道上皮结构重建[7]。EMT是气道上皮结构重建的关键环节，TGF-β1是EMT的强有力诱导因子。研究显示，COPD患者TGF-β1合成增多，与其支气管上皮细胞EMT密切相关[2, 4]。迄今，

低氧作为支气管、肺部疾病的重要病理生理改变，其对肺动脉平滑肌细胞的影响实验研究较多，但涉及支气管上皮细胞的则寥寥无几。Kim等[8]报告低氧可影响离体培养的人支气管上皮细胞的增殖和凋亡。重要的是，支气管上皮细胞是气道组织TGF-β1分泌的主要来源。Pählman等[9]研究发现，低氧时人支气管上皮细胞TGF-β1表达上调，后者可驱动支气管上皮细胞由铺路石样向梭形间充质细胞转变[10]。与以上结果一致，本研究发现低氧时大鼠支气管上皮细胞TGF-β1表达明显增多，细胞形态学亦发生梭形样改变。E-cadherin等上皮标志物的表达降低，而vimentin等间充质标志物表达增强。

细胞外基质过度分泌可促进细胞的EMT进程；而LOX是细胞外基质的重要催化酶[11]。研究认为，LOX与肺泡II型上皮细胞的EMT有关[12]。Boufraqech等[13]发现LOX可通过调控锌指蛋白转录因子Snai2的表达，参与肿瘤细胞的EMT。低氧是诱导

LOX表达的重要因素[ 11 ]。我们以往研究报道，低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞LOX表达上升，促进细胞外基质胶原沉积和交联[5, 14]。本研究显示，低氧下大鼠支气管上皮细胞LOX表达增多，胶原合成和交联增多，并被β-APN所逆转。LOX正是基于改变细胞外基质的组成成分，参与了支气管上皮细胞的EMT进程。Schietke等[15]研究就证实低氧可通过诱导LOX合成，抑制E-cadherin的表达[15]，加速细胞的EMT进程。

研究表明，TGF-β1对支气管上皮细胞EMT的影响与雌激素受体以及 Akt/GSK3β/ Snail1信号通路的活化有关[10, 13, 16]。有意义的是，本研究显示低氧状态下支气管上皮细胞发生EMT，同时LOX表达增多。业已知道，低氧对LOX的表达调控是多途径的。低氧诱导因子1α能直接促进LOX的转录[12]。我们曾研究报道，低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞LOX表达的诱导作用与磷脂酰肌醇3激酶信号通路有关[5]。Aumiller等通过对人成纤维细胞予以TGF-β1孵育后，发现其可促进LOX表达[ 6 ]。在人皮肤组织中的研究显示，LOX抑制剂能拮抗TGF-β1诱导的皮肤组织细胞外基质的沉积以及成纤维细胞的活化[17]。但LOX对支气管上皮细胞EMT进程的影响是否也涉及TGF-β1信号的参与？在本研究中，大鼠支气管上皮细胞孵育TGF-β1后，可明显促进支气管上皮细胞LOX的表达，并呈浓度依赖性。应用TGF-β1受体阻断剂SB431542共同处理后，则TGF-β1和低氧对大鼠支气管上皮细胞LOX表达的诱导作用被削弱，TGF-β1和低氧引起的EMT进程被阻断，提示TGF-β1及其抑制剂通过影响LOX信号参与大鼠支气管上皮细胞EMT进程的调控。

综上所述，低氧能诱导大鼠支气管上皮细胞TGF-β1高表达，通过促进LOX合成，致使其向EMT转化。