大黄素对洛哌丁胺致小鼠便秘的治疗作用*

计树灵， 韩佳瑞， 贺璐璐， 左振魁△

[1河南中医药大学， 2河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)肛肠科， 河南 郑州 450000]

便秘是一种常见的胃肠功能紊乱性疾病，严重影响了人们的生活质量[1]。并且，长期慢性便秘是结肠癌、心脑血管病、抑郁和帕金森等疾病的潜在诱因之一[2-3]。目前常用治疗便秘的药物(如莫沙必利、西沙比利和普卢卡必利等)存在心血管不良等副作用[4]。而益生菌制剂对便秘的治疗效果并不太理想[5]。Zheng等[6]报道，大黄素(emodin)能通过上调便秘小鼠肠组织中水通道蛋白3(aquaporin 3，AQP3)表达来改善胃肠蠕动而促进排便。然而，大黄素对便秘小鼠致泻的具体机制并不清楚。因此，本项工作应用洛哌丁胺(loperamide，Lop)构建小鼠便秘模型，观察大黄素对便秘小鼠的治疗作用及其潜在的机制。

材 料 和 方 法

1 试剂

一氧化氮(nitric oxide，NO)检测试剂盒购自Promega；RIPA裂解液购自Solarbio；BCA蛋白测定试剂盒购自Thermo；免疫组化检测试剂盒购于南京建成生物公司；HE染色试剂盒购自广州赖德生物公司；抗血管活性肠肽受体1(vasoactive intestinal peptide receptor 1，VIPR1)、5-羟色胺4型受体(5-hydroxytryptamine type 4 receptor，5-HT4receptor)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抗体购自Abcam；瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1)抗体购自Abnova；抗c-Kit、干细胞因子(stem cell factor，SCF)和β-actin抗体购自Santa Cruz；HRP标记的IgG II抗购自上海碧云天公司；洛哌丁胺试剂购自Sigma-Aldrich。

2 实验动物及分组

35只7～8周龄SPF级雄性昆明小鼠[(30±4)g]购自河南省实验动物中心【SCXK(豫)2017-0001】，小鼠饲养在河南中医药大学SPF级动物房内【SYXK(豫)2015-0005】，室温(23±1)℃，昼夜循环12 h，小鼠可自由进食进水。小鼠饲养1周后随机分为对照(control，Con)组(11只)、Lop组(12只)和Lop+emodin组(12只)组。Lop组小鼠每天早、晚各灌胃1次Lop(9.6 mg/kg)，持续2周。Lop+emodin组小鼠灌胃Lop时间与频率同Lop组小鼠，持续2周，但在灌胃Lop 1周后，每天再灌胃1次大黄素(50 mg/kg)，持续1周。对照组每天灌胃相同体积生理盐水。

3 方法

3.1便秘行为观察以及粪便含水量检测 给药结束后，小鼠在代谢笼中自由活动2 h，记录小鼠排便次数并收集粪便。随后对粪便称重，在50 ℃烘干4 h后再次称重。粪便含水量(%)=(湿重-干重)/干重×100%。

3.2肠通过时间检测 小鼠禁食12 h，然后对小鼠进行灌胃钡餐(15% BaSO4，每只灌胃1.5 g)，随后记录第1次白色粪便排出时间。

3.3血清NO检测 小鼠禁食12 h后，乙醚麻醉小鼠，摘掉眼球，通过眼眶取血，每只小鼠取血0.6 mL。血液在室温静置30 min，待血液凝固后，2 000×g离心5 min，收集血清。按照试剂盒说明书步骤进行检测血清中NO含量。待反应结束后，通过酶标仪检测540 nm处吸光度(A)值，并根据预先制作的NO吸光度值的标准曲线，计算血清中NO含量。

3.4结肠组织收集 乙醚过量麻醉处死小鼠后，分离小鼠结肠组织。组织分为两部分，一部分冻存在-80 ℃冰箱，另一部分固定在4%福尔马林缓冲液中，24 h后进行石蜡包埋处理。

3.5HE染色 取小鼠结肠石蜡组织，经石蜡切片机切为5 μm厚度的石蜡切片。切片在二甲苯中脱蜡，随即在梯度乙醇中脱水，然后复水后，按照HE染色试剂盒说明书步骤，对结肠组织切片进行HE染色，显微镜下观察结肠组织形态学变化。

3.6免疫组化 小鼠结肠石蜡切片在二甲苯中脱蜡，随即在梯度乙醇中脱水，在柠檬酸盐煮沸后冷却，加入山羊血清37 ℃封闭。在37 ℃条件下，切片用I抗VIPR1和5-HT4receptor(1 ∶500)孵育2 h。PBS冲洗切片3次，每次3 min，随后在37 ℃条件下，用HRP标记的IgG(1 ∶200)孵育1 h。PBS冲洗切片3次，每次2 min，用AB过氧化物酶(1 ∶200)染色45 min，用DAB溶液显色5 min，苏木精复染1 min。中性树胶封片后在光学显微镜下观察。随机选取3个视野，通过ImageJ软件分析。

3.7Western blot实验 取小鼠结肠组织，经常规匀浆后，用RIPA裂解液从结肠组织中提取总蛋白。使用BCA试剂盒进行蛋白定量。每样品取30 μg蛋白，经煮沸变性后，进行10%SDS-PAGE。电泳分离的蛋白经电转移至PVDF膜。转膜后，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，随后分别加入1抗(TRPV1 1 ∶500，GDNF 1 ∶500，BDNF 1 ∶1 000，NOS 1 ∶500，c-Kit 1 ∶1 500，SCF 1 ∶500)，4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜后，加入HRP标记的IgG II抗，在室温下孵育1.5 h。TBST洗膜后，在暗室用ECL显影液使得目的条带形象化，然后曝光于胶片。采用Quantity One 软件分析条带的灰度值。

4 统计学处理

数据表示为均数±标准误(mean±SEM)，使用SPSS 20.0统计分析。多组比较采用采用单因素方差分析(one-way ANOWA)并以Fisher′s最小显著差异(least significant difference，LSD)法进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大黄素对便秘小鼠肠功能的影响

在排便观察的2 h内，与对照组比较，Lop组小鼠的排便次数和粪便含水量均显著降低(P0.01)；与Lop组比较，Lop+大黄素组小鼠排便次数和粪便含水量均显著增加(P<0.05或P<0.01)，见图1A、B。检测粪便在肠通过时间的结果显示，与对照组比较，Lop组小鼠肠通过时间显著增加(P<0.01)；与Lop组比较，Lop+大黄素组小鼠肠通过时间显著降低(P<0.01)，见图1C。

Figure 1.Effect of emodin on intestinal function in Lop-induced constipation mice. A: statistical results of the defecation frequency within 2 h; B: statistical results of the fecal water content; C: statistical results of the gastrointestinal transit time. Mean±SEM. n=11 in control (Con) group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs Lop group.

2 大黄素对便秘小鼠结肠炎症的影响

HE染色结果显示，对照组肠绒毛排列整齐；Lop组肠绒毛排列紊乱，且有炎症细胞侵润，肠壁(箭头)变薄；Lop+大黄素组肠绒毛排列和肠壁趋向正常，炎症细胞侵润减少，见图2。

Figure 2.Effect of emodin on the morphological changes of colon tissues in Lop-induced constipation mice (HE staining).

3 大黄素对便秘小鼠血清NO含量的影响

结果显示，与对照组比较，Lop组小鼠血清中NO水平显著增加(P<0.01)；与Lop组比较，Lop+emodin组小鼠血清中NO水平显著降低(P<0.01)，见图3。

Figure 3.Effect of emodin on the level of serum NO in Lop-induced constipation mice. Mean±SEM. n=11 in Con group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs Con group; **P<0.01 vs Lop group.

4 大黄素对便秘小鼠结肠组织中VIPR1和5-HT4受体表达的影响

免疫组化结果显示，与对照组比较，Lop组小鼠结肠组织中VIPR1表达水平显著增加(P<0.01)，5-HT4受体表达水平显著降低(P<0.01)；与Lop组比较，Lop+emodin组小鼠结肠组织中VIPR1表达水平(P<0.01)显著降低，5-HT4受体表达水平显著增加(P<0.01)，见图4。

Figure 4.Effect of emodin on the expression levels of VIPR1 and 5-HT4 receptor of colon tissues in Lop-induced constipation mice. Scale bar=50 μm. Mean±SEM. n=11 in Con group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs Con group; **P<0.01 vs Lop group.

5 大黄素对便秘小鼠结肠组织中肠神经相关因子表达的影响

Western blot实验结果显示，与对照组比较，Lop组小鼠结肠组织中TRPV1和NOS表达水平均显著增加(P<0.001)，GDNF和BDNF表达水平均显著降低(P<0.01)；与Lop组比较，Lop+大黄素组小鼠结肠组织中TRPV1和NOS表达水平均显著降低(P<0.01)，GDNF和BDNF表达水平均显著增加(P<0.05或P<0.01)，见图5。

Figure 5.Effect of emodin on the expression levels of enteric nerve-related factors of colon tissues in Lop-induced constipation mice. Mean±SEM. n=11 in Con group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs Con group; *P<0.05, **P<0.01 vs Lop group.

6 大黄素对便秘小鼠结肠组织中c-Kit和SCF表达的影响

Western blot实验结果显示，与对照组比较，Lop组小鼠组织中c-Kit和SCF的表达水平均显著降低(P<0.01)；与Lop组比较，Lop+大黄素组小鼠结肠组织中c-Kit和SCF的表达水平均显著增加(P<0.01)，见图6。

Figure 6.Effect of emodin on the expression levels of c-Kit and SCF of colon tissues in Lop-induced constipation mice. Mean±SEM. n=11 in Con group; n=12 in Lop and Lop+emodin groups. ##P<0.01 vs Con group; **P<0.01 vs Lop group.

讨 论

便秘是一种与排便异常相关的功能性胃肠道疾病。在我国，由于近年来生活节奏加快、饮食结构改变和老龄化加快等因素，便秘的发病率呈现逐年增加现象[7]。目前，临床上常见的抗便秘药物存在心血管不良的潜在风险[4]。本研究结果显示，大黄素能促进便秘小鼠排便并增加粪便含水量，并且降低粪便在肠通过时间。这一结果提示，大黄素具有缓解便秘的作用。

便秘与肠神经系统(enteric nervous system，ENS)失调相关。在ENS中，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和NO等均是与胃肠道蠕动活性相关的神经递质[8-13]。5-HT属于兴奋性神经递质，可直接作用于结肠黏膜上肠嗜铬细胞中5-HT4受体，引起肠道平滑肌收缩，促进肠道蠕动引起排便[8]；VIP属于抑制性神经递质，主要支配结肠下行性反射，能与VIPR1结合促进结肠阶段性蠕动增加，这些肠段过度蠕动甚至痉挛会导致推进型运动减弱[9-10]。在本研究中，大黄素处理的Lop致便秘小鼠中5-HT4受体显著增加，而VIPR1水平显著降低。另外，VIP还能通过促进靶细胞合成NO[11]。NO是ENS中非特异性抑制性神经递质，过量NO可通过扩散方式进入肠道平滑肌细胞，减少细胞内Ca2+浓度，从而使肠道阶段式平滑肌过度舒张，导致过度的肠阶段性蠕动(肠痉挛)[12]。本研究观察到Lop致便秘小鼠血清中NO含量升高，而大黄素处理后的Lop致便秘小鼠的血清NO含量趋向正常。这一结果说明，大黄素能降低便秘小鼠血清NO水平。NOS是内源性NO生成的限速酶，抑制便秘小鼠肠组织中NOS的表达能减少NO过量生成，进而缓解便秘[13]。因此，本研究进一步检测小鼠结肠组织中NOS的表达，结果显示，大黄素可下调便秘小鼠结肠组织NOS的表达。这些结果提示，大黄素缓解便秘的作

用可能与降低抑制性神经递质和促进兴奋性神经递质有关。

Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是胃肠道起搏细胞，在ENS传导中起重要作用，可将神经信号传递至肠道平滑肌[14]。一项研究[15]表明，便秘患者ICC密度低于正常人，而ICC密度降低导致ICC自发节律性慢波作用丧失、结肠运动紊乱。c-Kit及其配体SCF是ICC生长、发育和维持的主要因素[16]。据报道[17]，在便秘小鼠结肠中ICC密度、c-Kit以及SCF表达均降低。本研究显示，大黄素可促进便秘小鼠结肠组织中c-Kit和SCF表达。

BDNF也是ENS中重要的神经因子，BDNF表达降低可使肠平滑肌继发性变性进而导致肠蠕动失常[18]。平滑肌细胞来源GDNF是影响ENS的重要因素，其表达减少或缺失会导致肠神经元的结构和功能紊乱[19]。本研究结果显示，大黄素处理的Lop致便秘小鼠结肠组织中BDNF和GDNF水平显著增加。

VIPR1还能抑制巨噬细胞活性和T细胞增殖[20]。巨噬细胞和T细胞在炎症浸润过程中起重要作用。长期便秘可引起肠道便秘相关性损伤和炎性反应。TRPV1的异常高表达正是肠道损伤的一个重要特征[21]。TRPV1是通过参与疼痛传递以及多种疼痛信号的整合来调节肠道蠕动[21]。过度激活TRPV1可诱导持续性神经递质释放，导致胃肠运动功能紊乱[21-22]。研究报道[22]，TRPV1高表达常见于便秘导致的肠道损伤患者。而GDNF表达的增强有助于修复受损的胃肠道，从而有助于避免或缓解便秘[18]。本研究观察到，大黄素处理的Lop致便秘小鼠结肠组织中炎性浸润和VIPR1、TRPV1表达均降低，GDNF表达水平增加。提示，大黄素抑制Lop致便秘相关的结肠炎症和损伤的作用在一定程度上与抑制VIPR1和TRPV1表达水平和促进GDNF表达水平有关。

综上所述，大黄素可能通过修复Lop导致的ENS失调来改善便秘小鼠肠道蠕动，减轻便秘相关结肠炎症和便秘症状。