丙泊酚对人胃癌细胞SGC-7901侵袭和迁移能力的影响*

张志发， 龙 思， 吴娅琴， 王学仁

(华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科， 湖北 武汉 430030)

恶性肿瘤术后转移和复发是影响患者预后的主要因素之一。近年研究发现恶性肿瘤术后发生局部复发和远处转移不仅与其自身的异质性相关，也与围术期麻醉药物的使用有关。丙泊酚(propofol)是一种常用的静脉麻醉药，被广泛应用于各类肿瘤手术的诱导、维持以及术后ICU的镇静，其对肿瘤细胞生物学特性的影响亦引起较多的关注。目前研究报道丙泊酚对肿瘤细胞侵袭和迁移能力的影响具有双向性，既具有抑制卵巢癌细胞侵袭能力的功能[1]，也具有促进胆囊癌细胞增殖和侵袭能力的特性[2]，甚至于对同一组织类型来源而分化程度不同的肿瘤细胞株的影响也不尽相同[3-4]。因此，丙泊酚对肿瘤细胞生物学特性的影响及机制值得深入的研究。较多的临床研究证实，富半胱氨酸血管生成诱导因子61(cysteine-rich angiogenic inducer 61,CYR61)、CD44v6[5]和基质金属蛋白酶7(matrix metalloprotei-nase-7,MMP-7)[6]3种分子与术后胃癌发生远处转移的风险密切相关，但丙泊酚是否影响上述3种蛋白的表达进而改变胃癌细胞侵袭和转移的特性，目前尚不清楚。本研究以人胃癌细胞SGC-7901作为研究对象，探讨临床浓度的丙泊酚对其CYR61、CD44v6和 MMP-7的表达及体外侵袭和迁移能力的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901购自中科院上海生物化学与细胞生物学研究所，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，其中添加1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素。在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代，选用对数生长期细胞进行后续实验。DMSO溶解丙泊酚至所需浓度进行后续实验。

2 主要试剂

RPMI-1640和胎牛血清(HyClone);丙泊酚(Sigma);DMSO(Sigma);兔抗CYR61抗体(CST);鼠抗CD44v6抗体和兔抗MMP-7抗体(Abcam)。酶标仪(Thermo Fisher Scientific)；Matrigel(BD)。

3 主要方法

3.1MTT法测定细胞活力 细胞培养至对数生长期后，以5×107/L细胞密度接种于96孔板，每孔100 μL，设置5个复孔。加入不同浓度(1、3、5和7 mg/L)丙泊酚处理，继续培养细胞24 h，随后每孔加入90 μL新鲜培养液和10 μL MTT溶液，继续培养4 h。吸除培养液，加入DMSO溶液150 μL并振荡反应10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪检测490 nm 处吸光度(A)值，计算细胞的相对活力。细胞相对活力(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

3.2细胞侵袭实验 将稀释后的Matrigel(每孔30 μL)平铺于Transwell板上室中，37 ℃静置3 h，制成凝胶备用。Transwell板下室中每孔加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，上室中每孔加入300 μL含不同浓度丙泊酚的无血清细胞悬液(细胞密度为1×108/L)。在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，取出小室，吸除培养液，擦拭小室上层未侵袭的细胞，甲醇固定30 min，结晶紫染色5 min，将小室倒置，显微镜下观察小室滤膜底下室附着的细胞，进行观察并拍照。每组随机选取5个视野，计数每一视野内穿过膜的细胞数。实验重复3 次，每个实验5个复孔。

3.3划痕愈合实验 以1×108/L的密度接种于6孔板中，待细胞融合度达到80%后，换无血清培养基同步化12 h。用1 mL枪头在单层细胞上做线性划痕，弃掉培养基，PBS洗3遍，每孔加入含不同浓度丙泊酚的完全培养基，在显微镜下观察并拍照记录划痕宽度，记为0时划痕宽度。继续培养24 h后在同一观察点测量划痕宽度，计算细胞划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h 划痕宽度×100%，实验重复3次，每个实验5个复孔。

3.4Western blot实验 丙泊酚处理细胞24 h后，加入适量的RIPA全裂解液裂解，提取细胞总蛋白，利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。在细胞总蛋白样品中加入loading buffer，沸水使其充分变性。然后，用SDS-PAGE分离蛋白，经蛋白转膜、封闭、Ⅰ抗(CYR61抗体1∶1 000稀释，CD44v6抗体1∶1 000稀释，MMP-7抗体1∶600稀释)及Ⅱ抗孵育杂交后进行ECL化学发光反应。以β-actin 为内参照，对条带进行灰度扫描，比较各蛋白的表达变化。

3.5细胞免疫组化 取对数生长期的细胞，经胰酶消化后调整细胞密度至1×108/L。将无菌处理的盖玻片均匀铺于6孔板中，接种细胞悬液后培养24 h，吸除培养基，PBS洗3遍，加入丙泊酚处理上述细胞24 h后取出盖玻片进行免疫组化染色。PBS漂洗、4%多聚甲醛固定以及0.5% Triton X-100 37 ℃温育后，3% H2O2作用15 min，滴加山羊血清工作液封闭，进行Ⅰ抗孵育(CYR61抗体1∶100稀释，CD44v6抗体1∶500稀释，MMP-7抗体1∶100稀释)，放入湿盒4 ℃过夜，PBS清洗3遍，滴加生物素化Ⅱ抗工作液室温孵育30 min，PBS 洗3 遍，滴加二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色液，自来水冲洗，苏木素复染，常规脱水封片，以出现棕黄色或棕色颗粒的细胞作为阳性细胞。结果判断根据细胞染色程度积分与其所占百分比积分的乘积进行评分。染色强度计分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；在100倍镜下任意选取10个视野，400倍镜下在每一个视野中连续计数100个细胞，记录其中阳性细胞数，计算阳性细胞百分数，取平均数后从0到4分评分。≤10%为0分；11%～30%为1分；31%～50%为2分；51%～70%为3分；≥70%为4分，两者得分乘积0～3分判定为低表达，≥4分判定为高表达。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件对数据进行分析处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较用t检验，多组间用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 丙泊酚对胃癌细胞SGC-7901活力的影响

各组细胞相对活力依次为：100%(对照组)、(95±8)%(DMSO组)、(87±6)%(1 mg/L组)、(90±7)%(3 mg/L组)、(87±9)%(5 mg/L组)和(66±11)%(7 mg/L组)；与对照组相比，7 mg/L丙泊酚抑制SGC-7901细胞活力(P<0.05)，见图1。因此，后续实验采取5 mg/L的浓度作为实验浓度。

Figure 1.Effect of propofol on the viability of gastric cancer cell line SGC-7901. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

2 丙泊酚对胃癌细胞SGC-7901侵袭能力的影响

各组穿透小室膜底细胞数依次为：25±4(对照组)、22±3(1 mg/L组)、21±6(3 mg/L组)和15±2(5 mg/L组)；与对照组相比，5 mg/L丙泊酚组穿透膜底的细胞数显著减少(P<0.05)，见图2。

Figure 2.Effect of propofol on the invasion ability of gastric cancer cell line SGC-7901 (×200). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

3 丙泊酚对胃癌细胞SGC-7901迁移能力的影响

SGC-7901细胞经不同浓度丙泊酚处理24 h后，划痕实验结果显示各组细划痕愈合率分别为：(37.4±5.6)%(对照组)、(33.7±1.7)%(1 mg/L组)、(31.3±2.4)% (3 mg/L组)、(20.4 ±1.0)% (5 mg/L组)；与对照组相比，5 mg/L丙泊酚组愈合率显著下降(P<0.05)，见图3。

Figure 3.Effect of propofol on the migration ability of gastric cancer cell line SGC-7901 (×100). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

4 丙泊酚对胃癌细胞SGC-7901中CYR61、CD44v6和MMP-7表达的影响

SGC-7901细胞经5 mg/L丙泊酚处理后，CYR61主要定位于细胞膜和近膜的胞质，对照组与实验组均呈低表达，极少数细胞呈散在棕黄色染色，两组间未见明显差异(P>0.05)；CD44v6主要表达于细胞膜，呈棕黄色散在分布，胞浆少量可见，对照组表达强度和比例高于实验组(P<0.05)；MMP-7主要表达于细胞胞质内，棕色颗粒弥漫分布，对照组表达高于实验组(P<0.05)，见图4A。Western blotting结果与上述结果一致，见图4B。

Figure 4.5 mg/L propofol suppressed the protein expression of CD44v6 and MMP-7 in gastric cancer cell line SGC-7901. A: detection of CYR61, CD44v6 and MMP-7 expression was performed by immunocytochemistry (×400); B: detection of CYR61, CD44v6 and MMP-7 expression was performed by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

讨 论

本研究发现丙泊酚可下调胃癌细胞SGC-7901 CD44v6和MMP-7蛋白的表达，并抑制其侵袭和迁移能力，初步证实了丙泊酚对胃癌细胞SGC-7901的抗肿瘤特性及相关分子机制。丙泊酚的血浆靶浓度约3～8 mg/L[7]，本研究以胃癌细胞SGC-7901为研究对象，发现5 mg/L丙泊酚可在不影响细胞活力的基础上抑制胃癌细胞SGC-7901的侵袭和转移能力，而7 mg/L丙泊酚则呈现抑制胃癌细胞SGC-7901活力的特性，是否会影响细胞的侵袭和转移能力尚待证实。

肿瘤细胞侵袭能力的改变多与介导细胞-细胞或细胞-间质之间相互作用的黏附分子以及分泌降解细胞外物理屏障酶的基质金属蛋白酶家族成员有关，尤其是黏附分子CD44v6和MMP-7，其与胃癌的组织分型及侵袭转移能力密切相关。CD44v6为细胞黏附分子CD44 基因v区外显子通过剪接后形成的拼接变异体，可改变肿瘤细胞表面黏附分子的结构和功能，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[8]。CD44v6与胃癌浸润深度、淋巴结的转移及病理分期的密切关系，更是其判断胃癌侵袭转移能力的重要指标[9]。另外，CD44v6-HA交联反应也可募集MMPs等特定的细胞因子，促进肿瘤细胞存活和转移[10]。MMP-7作为MMPs家族中重要的亚型，可通过酶解作用克服细胞外基质和多种细胞因子构成的物理化学屏障，降解ECM成分导致肿瘤的侵袭转移[11]。MMP-7作为MMPs家族中唯一在胃癌中存在差异表达的基因，表达越强，胃癌的恶性程度越高[12]。虽然一些研究报道了丙泊酚可通过调控MMPs家族某些亚型影响肿瘤细胞生物学特性，但目前尚未发现丙泊酚是否可直接调控MMP-7或通过MMP-7间接调控MMPs家族的其它亚型进而影响胃癌细胞的侵袭能力。在本实验中，我们发现5 mg/L丙泊酚处理胃癌细胞SGC-7901后，CD44v6和MMP-7的表达被抑制，推测丙泊酚导致侵袭能力下调的分子机制可能与这2个因素有关，但CD44v6是否通过与HA交联的方式调控MMP-7的表达需要进一步的研究。

CYR61是一个由381个氨基酸组成的分泌蛋白，属于CCN家族成员之一，在不同类型肿瘤中存在差异表达的现象，揭示其既具有癌基因的作用也能发挥抑癌基因的功能[13-14]。在胃癌研究中发现其表达也存在不一致性，Wei等[15]发现在胃癌组织及细胞中高表达CYR61，整合素αvβ3/NF-κβ信号参与了其侵袭能力的调控[16]；而Maeta等[17]的研究则发现CYR61蛋白在共表达5-羟色胺、高侵袭性的胃癌细胞中低表达，且与MMP-7的表达存在负相关性，其机制可能与CYR61通过调控整合素αvβ1抑制FAK或E1AF的活化相关[18]。但在本研究中，我们发现5 mg/L 丙泊酚处理胃癌细胞SGC-7901对其CYR61的表达并无影响，也未见CYR61与MMP-7表达的相关性，推测其可能与该基因下游靶基因整联蛋白以及细胞系的差异有关。

综上所述，临床相关浓度的丙泊酚可抑制胃癌细胞SGC-7901的侵袭和迁移能力，与抑制细胞活性无关，其机制可能与CD44v6/MMP-7等参与细胞黏附和基质降解等过程的分子有关。