黄连素对冠心病大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制研究

冠心病(coronary heart disease，CHD)是严重危害人类健康的疾病，近年来，CHD 的发病趋势逐年上升，且发病率趋于年轻化[1]。CHD最直接的影响就是心肌缺血从而导致心脏的供氧减少，不能支持心脏正常工作，甚至导致部分心肌细胞凋亡[2-3]。黄连素(berberine，BBR)是从黄连、黄柏等植物中提取的生物碱，具有一定的抗菌和降血脂作用[4]。研究报道，黄连素可能通过促进抗氧化核转录因子Nrf2表达，对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤后的凋亡具有显著的抑制作用[5]。黄连素可抑制ERK1/2途径，减轻大气细颗粒物对EA.hy926内皮细胞诱导的损伤凋亡[6]。提示黄连素对包括心肌细胞在内的多种细胞凋亡具有抑制作用。但黄连素在抑制心肌细胞凋亡中的机制还不完善。因此，本研究通过建立冠心病大鼠模型，观察黄连素对模型动物心肌凋亡的作用，探讨其在上述作用中的信号机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠50只，体重(200±20)g，常州卡文斯实验动物有限公司，动物质量合格证号：No.201722172。

1.2 实验试剂 黄连素(国药集团化学试剂有限公司)，脑垂体后叶素(南京新百药业有限公司)，Caspase 3、Bcl-2、Bax、Calpain1、Calpastatin抗体及羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP 二抗(美国CST公司)，GAPDH 抗体(Bioworld公司)，RIPA裂解液、BCA试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ荧光定量试剂盒及引物(大连TaKaRa公司)。

1.3 主要仪器 PIPETMANL微量可调加样器(法国Gilson公司)；Allegra 64R Centrifuge台式高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司产品)；MiniVE电泳设备(美国GE公司产品)；ABI Prism®7300型荧光定量PCR仪(美国ABI公司产品)。

1.4 动物模型的建立及给药 参考文献[7]方法建立冠心病大鼠模型，每天给予高脂食物连续喂养6周；间隔 24 h腹腔注射垂体后叶素30 μg/kg，连续 3 次。将模型动物分为实验组和对照组，实验组30只，对照组10只。实验组予以高[100 mg/(kg·d)]、中[50 mg/(kg·d)]、低[25 mg/(kg·d)]剂量黄连素灌胃，每剂量组10只大鼠；对照组每天予以等黄连素体积的双蒸水灌胃。本实验同时以正常SD大鼠10只设立空白组，予以等黄连素体积的双蒸水灌胃，实验动物治疗周期为12周。

1.5 酶联免疫吸附法(ELISA)和硝酸酶还原法检测血清炎症因子含量 参考文献[8]并根据说明书进行实验操作，检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量变化。

1.6 实时荧光定量(RT-qPCR)检测心肌细胞中Calpain1和Calpain2 mRNA水平变化 收集各组大鼠的心肌组织，部分进行RT-qPCR检测。按文献[9]方法进行RNA提取和纯化、RT反应、qPCR反应，并分析实验结果。

1.7 蛋白印记实验分析各组大鼠相对蛋白表达量 收集各组模型大鼠的心肌组织。参考文献[10]的方法进行蛋白提取、SDS-PAGE电泳、转膜，及封闭。按需求加入Caspase 3抗体(1∶1 000)、Bcl-2抗体(1∶2 000)、Bax抗体(1∶2 000)、Calpain1抗体(1∶1 000)、Clapastatin抗体(1∶1 000)及DAPDH(内参)抗体，4 ℃温育过夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温杂交1 h，PVDF膜以化学发光试剂盒进行显色，用Syngene Imaging System进行成像，用Image J对蛋白印迹条带进行处理和分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较 与空白组相比，对照组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著上升(P<0.05)；与对照组相比，高、中、低剂量实验组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均有不同程度下降(P<0.05)。详见表1。

2.2 各组大鼠心肌Calpain1和Calpain2 mRNA水平比较 与空白组相比，对照组Calpain1 mRNA相对水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；Calpain2 mRNA无明显变化；与对照组相比，高、中、低剂量实验组Calpain1 mRNA相对水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；而Calpain2无明显变化。详见图1。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较(±s) ng/L

1) 与空白组比较，P<0.05；2) 与对照组比较，P<0.05

※对照组与空白组比较，P<0.01；与对照组比较，#P<0.05，△ P<0.01图1 各组大鼠心肌Calpain1和Calpain2相对mRNA表达水平比较

2.3 各组大鼠心肌Calpain1及Calpastatin相对蛋白表达水平 与空白组相比，对照组大鼠心肌组织Calpain1蛋白表达量增多(P<0.01)，而Calpastatin蛋白表达量明显下降(P<0.01)；与对照组相比，高、中、低剂量实验组大鼠心肌组织Calpastatin蛋白表达明显增多(P<0.05或P<0.01)，而Calpain1蛋白表达显著下降(P<0.01)，并呈剂量依赖性。详见图2、表2。

a为空白组；b为对照组；c为高剂量组(实验组)；d为低剂量组(实验组)；e为中剂量组(实验组)图2 蛋白印迹检测各组大鼠心肌Calpain1和Calpastatin相对蛋白表达水平

表2 各组大鼠心肌组织Calpain1和Calpastatin相对蛋白表达水平比较(±s) %

1) 与空白组比较，P<0.01；与对照组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

2.4 各组大鼠心肌Cleaved-Caspase 3、Bcl-2、Bax相对蛋白表达水平比较 与空白组相比，对照组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达量明显降低(P<0.01)，而Bax和Cleaved-Caspase 3蛋白表达升高(P<0.01)；与对照组相比，实验组大鼠心肌Bcl-2蛋白表达增多，Bax和Cleaved-Caspase 3蛋白表达明显下降，并呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见图3、表3。

a为空白组；b为对照组；c为高剂量组(实验组)；d为低剂量组(实验组)；e为中剂量组(实验组)图3 蛋白印记实验检测各组大鼠心肌Bcl-2、Bax和Cleaved-Caspase 3相对蛋白表达水平

表3 各组大鼠心肌Bcl-2、Bax及Cleaved-Caspase 3相对蛋白表达水平比较(±s) %

1) 与空白组比较，P<0.01；与对照组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

3 讨 论

CHD为冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧的疾病。临床研究表明，CHD病人血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6升高[11]。本研究结果显示，模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6显著上升，这与临床研究相一致。进一步研究发现，3种剂量黄连素治疗12周后，模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6均降低，提示黄连素可减缓模型大鼠炎症反应。在正常情况下，心肌在缺血缺氧时即可发生细胞凋亡现象[12]。本研究发现，与正常大鼠比较，模型大鼠Bcl-2蛋白表达量降低，而Bax和Cleaved-Caspase 3表达升高，提示模型大鼠心肌细胞发生一定程度的凋亡；黄连素治疗后模型大鼠Bcl-2蛋白表达量升高，而Bax和Cleaved-Caspase 3表达量降低，提示黄连素对CHD大鼠心肌凋亡有抑制作用。

凋亡拥有复杂的信号调节机制，但黄连素与凋亡的调节机制还未完全明确。Calpain属于Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶水解家族。研究表明，广泛表达的Calpain可分为Calpain1和Calpain2，二者活性受到其天然的活性抑制分子Calpastatin的抑制[13]。研究报道，Calpain在线粒体途径、死亡受体途径乃至内质网应激途径中都发现其促凋亡作用[13]。为观察Calpain是否参与黄连素对心肌凋亡的影响，本研究检测了心肌Calpain1和Calpain2 mRNA表达变化，发现模型大鼠心肌Calpain1 mRNA显著升高，而黄连素治疗后Calpain1 mRNA下降，在蛋白水平上也观察到了类似的结果。本研究发现，Calpastatin蛋白表达与Calpain1呈相反趋势，Calpastatin为Calpain的天然活性抑制分子。提示在模型大鼠心肌中Calpain1活性升高，黄连素治疗后Calpain1活性降低。有文献报道，在缺血缺氧脑损伤新生大鼠心肌中Calpain1剪切体增多，活性升高，且与细胞凋亡有关[14]。提示黄连素可能通过降低Calpain1活性抑制心肌细胞凋亡。有研究表明，Calpain可剪切凋亡执行蛋白Caspase-7及促凋亡蛋白Bax和Bid[13]。而本研究未观察黄连素是否参与上述凋亡信号转导，因此还有待于进一步研究。

综上所述，黄连素能降低CHD大鼠心肌细胞凋亡，该作用可能与增强Calpain1蛋白表达和活性，下调血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量有关。