骨肉瘤组织中巨噬细胞炎性蛋白4的表达及其与肺转移的相关性

丁晓敏 胡海燕

上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科（上海200233）

骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤，其好发于儿童和青少年。骨肉瘤最常见的好发部位是长骨的干骺端，如股骨远端及胫骨近端等［1］。由于医学技术的迅猛发展，现通过新辅助化疗、手术切除、辅助化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种方式联合治疗，原发性骨肉瘤患者的5年内生存率已经被提高到70%左右［2-3］。但是骨肉瘤极易发生局部复发和早期转移，肺转移占据了骨肉瘤患者转移部位的80%以上［4］。一旦发生肺转移，患者的5年内生存率就降低至20%～30%。因此，探究骨肉瘤转移的相关机制极为重要。

巨噬细胞炎症蛋白4（macrophage inflammatory protein 4，MIP4）即趋化因子配体18（chemokine ligand 18，CCL18），属于CC 趋化因子家族成员，与CCL13 分子结构最为相似，CCL18 与其他巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein，MIPs）一起位于17 号染色体上［5］。该基因本身有3 个外显子和2 个内含子，但与其他趋化因子不同的是，CCL18 的第一个内含子中包含2 个假外显子（最终肽中不出现的外显子）。通过这些假外显子，人们认为MIP4/CCL18 是由CCL13 样蛋白编码基因之间的基因融合事件所产生的，并且由于积累突变，CCL18 随着时间的推移获得了不同的功能［6］。MIP4/CCL18 在不同的白介素因子刺激下与PITPNM3，GPR30，CCR8 等不同受体结合，在机体的炎症反应和免疫应答中发挥了各种作用［7］。除此之外，也有一些研究表明MIP4/CCL18 在多种肿瘤中高表达，并与肿瘤的转移和进展相关，例如PINTO 等［8］发现MIP4/CCL18 在进展期的结直肠癌中高表达并介导了巨噬细胞分化、癌细胞侵袭这一过程。然而，MIP4/CCL18 在骨肉瘤中的研究鲜有报道。因此，本研究旨在评估MIP4/CCL18 在骨肉瘤原发组织和肺组织的表达情况，并探讨其与患者的预后关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2011年1月至2013年12月来我院诊治的骨肉瘤继发肺转移病人的原发灶肿瘤组织标本75例及配对的肺组织标本31例。所有患者均经病理确诊且病人信息完整。组织标本均来自手术和穿刺活检，标本经过4%甲醛固定后石蜡常规包埋。每个标本切片厚度是4 μm，连续切片不低于5 张。

1.2 方法及结果判定免疫组织化学采用SABC法进行染色，步骤参考试剂盒说明书。兔抗人一抗MIP4/CCL18 浓度为1∶100，山羊抗兔二抗浓度为1∶500。免疫组化试剂盒以及所有抗体均购于博士德生物工程有限公司。

免疫组织化学结果判定标准：细胞胞浆中出现棕黄色颗粒则为阳性，随机选取五个视野在高倍镜下观察计数（1）染色强度评分：不着色0 分，黄色1 分，棕黄色2 分，黄褐色3 分；（2）阳性细胞所占比例评分：阳性细胞数≤5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，≥76%为4 分。最终结果以染色强度和染色范围评分的乘机表示：阴性＝0 分，弱阳性＝1～4 分，阳性＝5～8 分，强阳性＝9～12 分，取中位值分为高表达组＞6 分，低表达组≤6 分。

1.3 统计学方法使用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。根据资料类型，采用Spearman 相关分析分析MIP4/CCL18 在原发组织和肺组织中表达量的关系。采用卡方分析分析MIP4/CCL18 表达量与骨肉瘤临床病理特征之间的关系，采用Kaplan-Meier 生存分析及Cox 风险回归模型分析判断预后，当P＜0.05 时分析，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织中MIP4/CCL18 的表达在所有病例中，MIP4/CCL18 在原发灶中的表达为10.85 ±3.73，在肺转移灶中的表达为8.51 ± 2.96。根据免疫组织化学结果判定标准将所有患者的原发灶评分都计算出来，接着取中位值，患者被分为低表达组和高表达组（5.29 ± 0.95vs. 11.45 ± 4.24）（图1）。

图1 原发灶和肺转移灶CCL18 表达情况Fig.1 CCL18 expression in primary tissue and lung tissue

2.2 MIP4/CCL18 表达水平相关分析经Spearman 相关分析发现，MIP4/CCL18 在骨肉瘤原发灶及其肺转移灶中的表达具有相关性（r＝0.527，P＜0.05）。MIP4/CCL18 与骨肉瘤患者临床病理特征的关系见表1，卡方分析显示，MIP4/CCL18 的表达量与患者的年龄、性别、肿瘤大小、坏死情况、病理类型及局部复发等方面的差异均无统计学意义（P＞0.05），但与临床分期和发生肺转移方面的差异具有统计学意义（P＜0.05）。利用Cox 风险回归模型分析结果显示，MIP4/CCL18 的表达量是骨肉瘤肺转移预后的独立危险因素（OR＝1.307，P＜0.05）。

表1 骨肉瘤组织中CCL18 的表达与临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between CCL18 expression and clinical features of OS samples

2.3 生存分析本研究的随访时间为6～36 个月，在所有75例患者中，35例因死亡而终止随访，其余40例至终点时仍生存。经统计分析，MIP4/CCL18 高表达组患者的总生存率较低表达组患者组低（P＜0.05）。见图2。

3 讨论

骨肉瘤的发展是一个多因素、多机制参与的复杂过程，早期易发生肺转移是其重要特点，也是影响患者生存预后的一大难题。目前，已有不少研究表明，肿瘤的增长和转移与其所处的微环境密切相关［9］。肿瘤相关巨噬细胞作为微环境的重要组成部分，其合成分泌的一系列细胞因子和趋化因子在肿瘤的侵袭、转移、血管生成和免疫抑制等生物学行为中发挥着重要作用［10］，其中，M2 型巨噬细胞与肿瘤发生转移的关系尤为密切［11-12］。

图2 CCL18 低表达和高表达患者的Kaplan-Meier 生存曲线Fig.2 Kaplan-Meier survival curve of patients with low/high CCL18 expression

MIP4/CCL18 是一种由M2 型巨噬细胞分泌的趋化因子［13］，它在多种肿瘤组织中都具有高表达。PHAM 等［14］通过RT-qPCR 验证了MIP4/CCL18在乳腺癌组织中的高表达情况并通过体内异种移植模型验证了MIP4/CCL18 可以通过触发IL-32θ所抑制的通路来促进乳腺癌的转移。WANG 等［15］的研究证实了在食管癌组织中MIP4/CCL18 的高表达意味着患者会有更差的预后，而且MIP4/CCL18 通过上调HOTAIR 促进了食管鳞状细胞癌的进展。ZHOU 等［16］则通过免疫组化检测了MIP4/CCL18 在胆囊癌组织和正常组织的表达，揭示了MIP4/CCL18 在癌组织中的表达明显高于正常组织，考虑其可能通过激活PI3K/Akt 这一信号通路来促使癌细胞发生迁移和侵袭。QIN 等［17］人用ELISA 检测了132例头颈部鳞状细胞癌患者，25例癌前病变患者及32例健康受试者的血样，发现头颈部鳞状细胞癌患者血样中MIP4/CCL18 的水平高于其他人，并揭示了MIP4/CCL18 是通过MTDH-NF-κB 这条通路来促进癌细胞的转移。不过，也有一些研究揭示了不同的现象。WU 等［18］发现胃癌早期患者外周血中MIP4/CCL18 的水平高于晚期。YUAN 等［19］分析了371例结肠癌患者癌组织中的MIP4/CCL18 表达水平，结果显示MIP4/CCL18 高表达患者的总生存率较长，由此可见MIP4/CCL18 在肿瘤中的作用并不单一、绝对。

目前MIP4/CCL18 在多种肿瘤中的表达情况及作用机制相继被揭示，但国内外却少有关于MIP4/CCL18 在骨肉瘤中的相关研究。本研究采用免疫组织化学染色的方法检测了骨肉瘤原发组织和肺转移组织的MIP4/CCL18 表达情况，结果发现原发灶MIP4/CCL18 高表达者，其肺转移灶的MIP4/CCL18 水平也会增高，接着笔者通过Spearman 相关分析证实了这两者之间的相关性，后续的Cox 模型也表明了MIP4/CCL18 是影响骨肉瘤患者肺转移预后的独立危险因素。曾经LIU 等［20］的研究指出，MIP4/CCL18 通过结合其同源受体PITPNM3 来激活下游信号通路从而促进了乳腺癌的侵袭转移，当MIP4/CCL18 与PITPNM3 的结合被阻断后，虽然异种移植模型的肿瘤生长未停止，但是肺转移却得到了抑制，由此可见，MIP4/CCL18 是影响肿瘤侵袭和肺转移的重要因子。接着，笔者在对75例骨肉瘤患者的临床病理特征分析中发现，MIP4/CCL18 的表达水平与临床分期及肺转移相关，生存期随访也显示了MIP4/CCL18 高表达组患者的总生存率低于低表达组，这预示着MIP4/CCL18 可以在临床上用作预测骨肉瘤患者预后的重要指标。

总之，MIP4/CCL18 在骨肉瘤发生肺转移的过程中起着重要作用，它既可以作为提示骨肉瘤患者发生肺转移的预测因子，也对指导骨肉瘤患者的临床预后有着重要的意义。不过，MIP4/CCL18促骨肉瘤肺转移的具体机制仍有待进一步研究，之后才有望为骨肉瘤的靶向治疗提供新的理论依据。