DOT1L在胃癌组织中的表达及其与预后的相关性

宋早智 王庆康 孙家和 刘雪 钱军

蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科（安徽蚌埠233000）

胃癌（gastric cancer）是最常见的恶性肿瘤之一，胃癌的发病率在世界排在第五位，而其死亡率达到了第3 位。而在中国，胃癌的发病率在所有恶性肿瘤中排在第2 位，死亡率排在第3 位。各国的癌症数据报告显示，近几年的胃癌发病率趋于稳定并有逐年下滑的趋势，但我国的胃癌发病率仍旧很高，占世界总发病率的40%以上［1-2］。

类端粒沉默干扰体1（disruptor of telomeric silencing 1-like，DOTIL）是一个在进化上保守的蛋白，在芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中通过筛选遗传基因时被首次发现，在低等生物中被称为DOT1（disruptor of telomeric silencing 1）蛋白，而在哺乳动物中保守的同源蛋白被称为DOT1 样蛋白，DOT1L 的过量表达则可以扰乱端粒的沉默。有研究表明DOT1L 不仅在白血病［3］中起关键作用，在实体肿瘤中也有重要作用，乳腺癌中提高DOT1L 表达量，可能增加BCAT1 表达，从而导致乳腺癌细胞球形形成和细胞迁移活性的改变［4］。卵巢癌中，DOT1L 通过H3K79 甲基化过表达转录调控CDK6 和CCND3 来驱动细胞周期进展，提示DOT1L 可能是卵巢癌预后评估和治疗干预的潜在靶点［5］。前期笔者通过Western Blot 发现，与癌旁正常组织相比，胃癌新鲜组织中DOT1L 表达量增高。然而尚未有学者就DOT1L 在胃癌中的表达及作用进行报道。因此，本研究通过免疫组化检测80例胃癌及对应癌旁正常组织中DOT1L 表达情况，旨在探讨DOT1L 在胃癌中表达及其与临床病理特征和预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取蚌埠医学院第一附属医院于2018年6-12月在肿瘤外科进行胃癌手术患者25例。所有病人术前均未接受过放疗化疗及其他抗肿瘤治疗，并于术前均有明确诊断及术后再次诊断为癌。共纳入25例癌组织及其相匹配的正常非癌性胃黏膜组织（距离肿瘤边缘＞4 cm）。手术切除后，立即放入-80 ℃冰箱保存，直至提取mRNA 及蛋白质。本研究已经通过蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会批准并取得患者知情同意。

1.2 主要试剂TRIzol®Plus RNA Purification Kit和Revert Aid First Strand cDNA short kit 由美国Invitrogen 公司生产；Power SYBR®Green PCR Master Mix 由瑞士Roche 公司生产；兔抗人DOT1L 单克隆抗体及兔抗人β-actin 单克隆抗体、鼠抗兔IgG 二抗均购自英国Abcam 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒由美国Thermo Fisher Scientific 公司生产。

1.3 胃癌DOT1L mRNA 提取、逆转录及qRTPCR 反应取胃癌及相配对的癌旁正常组织，使用TRIzol-氯仿-异丙醇法提取总RNA 后，逆转录cDNA。进行实时荧光定量PCR（引物由上海吉凯公司提供，引物序列见表1，以cDNA 为模板，β-actin 为内参，采用2-△△Ct方法计算DOT1L 的表达量。反应条件：（1）变性95 ℃15 s，（2）退火60 ℃25 s，（3）延伸72 ℃34 s。共40 个循环。

表1 PCR 引物序列表Tab.1 PCR primer sequence table

1.4 Western Blot 检测胃癌组织中DOT1L 蛋白取胃癌及相配对的癌旁正常组织，提取总蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量。取60 μL 总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后以4%BSA封闭2 h，漂洗。DOT1L 一抗以1∶1 000 稀释，β-actin 一抗以1∶2 000 稀释，4℃孵育过夜，漂洗。二抗以1∶5 000 稀释，室温孵育1 h，T-TBS 漂洗，显色。用Image J 分析目的条带与内参条带灰度值的比值来计算目的蛋白相对表达量。

1.5 免疫组化检测DOT1L 蛋白选取蚌埠医学院第一附属医院于2013年1月到2013年12月在肿瘤外科手术的胃癌组织蜡块80例，进行切片制备、脱腊、复水后对组织进行抗原修复，然后进行免疫反应，滴加一抗（1∶200），4 ℃冰箱孵育过夜。加二抗（1∶500），室温孵育1 h。DAB 化学染色，苏木素复染。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。阳性染色结果判断：胞浆中的染色面积和棕黄色颗粒决定是否为阳性细胞。

1.6 免疫组化结果判断采用二次计分法：每例标本随机计数5 个高倍视野（× 400），计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比。染色强度标准如下［6］：以基本色度标准，0 分无色，1 分淡黄色，2分棕黄色，3 分棕褐色。再将阳性细胞所占百分比计分，0 分为阴性，1 分为阳性细胞＜10%，2 分为11%～50%，3 分为51%～75%，4 分为＞75%。用染色强度得分和细胞数得分的乘积作为判断表达结果，若积分0～4 分为阴性，4～12 分为阳性。因此，本研究将DOT1L 阴性表达患者归为低表达组，阳性表达归为高表达组。免疫组化结果由两名以上高年资病理医师同时读片评定。

1.7 统计学方法采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，两组间比较用配对t检验，率的比较采用χ2检验，单因素及多因素分析采用Cox 比例风险回归模型，生存分析采用Kaplan-Meier 法计算。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DOT1L mRNA 在胃癌组织中表达与癌旁正常组织相比，胃癌组织中DOT1L mRNA 的表达水平明显增加，两者差异性具有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 胃癌组织与对应癌旁正常组织DOT1L mRNA 的表达Fig.1 Expression of DOT1L mRNA in gastric cancer tissues and adjacent tissues

2.2 DOT1L蛋白表达在胃癌组织中的表达DOT1L蛋白在170 kDa 处出现，以β-actin 为内参对照，DOT1L 蛋白在胃癌组织中明显高于癌旁正常组织中表达，见图2。

图2 胃癌组织（T）与癌旁正常组织（N）DOT1L 蛋白表达状况Fig.2 Expression of DOT1L protein in gastric cancer tissue（T）and paracancer normal tissue（N）

2.3 免疫组化检测DOT1L 蛋白表达在80例胃癌组织蜡块和与其相匹配的癌旁正常组织中，DOT1L 蛋白在癌组织中阳性表达明显高于癌旁正常组织（P＜0.001），见表2。DOT1L 阳性反应物定位于细胞胞浆中，见图3。

表2 DOT1L 在胃癌组织和癌旁正常组织的表达情况Tab.2 Expression of DOT1L in gastric cancer tissues and adjacent tissues 例（%）

图3 免疫组化检测DOT1L 蛋白在胃癌和癌旁正常组织的表达（×400）Fig.3 The expression of DOT1L protein in gastric cancer and adjacent normal tissues was detected by immunohistochemistry

2.4 DOT1L 蛋白表达与胃癌临床病理特征的相关性为了阐明DOT1L 潜在的预后作用，通过对免疫组化结果与患者临床病理资料的统计学分析可以发现，DOT1L 在胃癌中的表达与DOT1L 蛋白的表达量与分化程度（P＝0.002）、TNM 分期（P＝0.022）、淋巴转移（P＝0.032）有关，与年龄（P＝0.251）、性别（P＝0.808）、肿瘤部位（P＝0.450）、肿瘤大小（P＝0.489）和浸润深度（P＝0.703）无关，见表3。

2.5 DOT1L蛋白表达与胃癌患者预后的关系本组80例患者随访时间60 个月，死亡62 人，总生存率22.5%。对DOT1L 在胃癌中的表达进行K-M 分析，胃癌组织中DOT1L 阳性患者总体生存率（P＜0.001）显著高于DOT1L 阴性患者，见图4。

2.6 胃癌预后单因素及多因素分析采用Cox 比例风险模型分析后，单因素结果显示，DOT1L 阳性表达，侵犯程度T3-T4，TNM分期高，淋巴结转移，分化程度低是影响胃癌预后的危险因素。多因素分析显示，DOT1L阳性表达，淋巴结转移，TNM分期高是影响胃癌预后的独立因素（均P＜0.05），见表4。

图4 胃癌患者DOT1L 高表达组与DOT1L 低表达组5年生存率比较Fig.4 The 5 years survival rate in the DOT1L overexpression group was significantly lower than that in the DOT1L low expression group

3 讨论

近些年来，胃癌的治疗主要方式仍是以手术治疗为主，术前新辅助化疗和术后化疗放疗相结合为辅。这对于胃癌伴淋巴结转移的患者，明显提高了手术的疗效和患者的生存时间，但仍有超过一半的患者发生了局部复发和远处转移［7］。因此，对于胃癌患者早期发现、早期诊断、早期治疗对于病情控制、治疗方式选择、生存时间显得尤为重要。通常胃癌通过钡剂造影，彩超等进行筛查。而早期确诊则要通过胃镜取材，病理检验得到。这种方法入侵性强，伤害较大，对于患者较为不利。因而寻找胃癌相关的生物学指标，通过血清肿瘤标志物的检测对于早期胃癌的筛查具有重要意义。

表3 DOT1L 表达与患者临床病理因素的关系Tab.3 Relationship between DOT1L expression and clinicopathological factors in patients

众所周知，DOT1L 作为酵母中DOT1 的人类同源物，是组蛋白H3 第79 位赖氨酸（H3K79）的特异性的甲基转移酶。最近的研究表明，DOT1L 通过与MLL 融合伴侣蛋白（例如AF4，AF9，AF10 或ENL）结合，参与混合谱系白血病（MLL）- 重排白血病的起始和维持，导致H3K79 甲基化和过表达异常［8-10］。因此，对于这种类型的白血病，DOT1L的小分子抑制剂是一个非常重要的治疗靶点［11］。在实体脏器的恶性肿瘤中，YANG 等［12］认为，DOT1L 表达较高，经过肾透明细胞癌手术后的病人，其生存时间分期预后都较低表达患者更差。然而在紫外线诱导的黑色素瘤中，ZHU 等［13］却发现，DOT1L 和甲基化的H3K79 结合到DNA 损伤位点进行核苷酸切除修复，这表明，DOT1L 在紫外线诱导的黑色素瘤过程中起保护作用。这种与重排型白血病中DOT1L 所对应的靶基因不同，从而产生不一样的作用。

表4 DOT1L 表达以及临床特征对胃癌患者生存率的影响Tab.4 Impacts of DOT1L expressions，as well as clinical characteristics on the survival rates of gastric cancer patients

DOT1L 在肿瘤细胞的侵袭增殖信号途径中起着重要作用。在本课题中，笔者已经发现，正常胃组织中DOT1L 的表达情况明显低于癌组织中的表达，并且DOT1L 蛋白的表达与分化程度、TNM 分期、淋巴转移有关。通过多因素分析，DOT1L 高表达、TNM 分期、淋巴结转移与胃癌患者预后有明显的相关性。这些都提示DOT1L 可能是一种原癌基因，由此我们可以判断，检测胃癌组织中DOT1L 蛋白量有助于判断肿瘤的恶性程度和进展状态。但此实验仍无法对DOT1L 在胃癌中分子机制层面进行研究。下一步我们将进行胃癌不同种细胞间差异性分析，并通过敲低DOT1L 表达量，观察细胞增殖变化，

综上所述，DOT1L 在胃癌组织中存在基因和蛋白高表达的现象，其表达的强弱与胃癌的临床病理学具有相关性。