加味丹栀逍遥散联合脐带间充质干细胞治疗中风后抑郁症的临床观察*

陈晓辉， 王国强， 尚立芝△， 张紫娟， 杜红妍， 李 丹， 王 权，常学辉， 孙鸿昌， 王社言， 李耀洋， 张光远， 石龙涛

(河南中医药大学 1科研实验中心， 2第一临床医院， 河南 郑州 450046；3河南中医药大学基础医学院， 河南 郑州 450046； 4河南省人民医院， 河南 郑州 450003； 5郑州大学附属郑州中心医院病理科， 河南 郑州 450007； 6河南中医药大学第二附属医院神经内科， 河南 郑州 450002； 7河南省洛阳正骨医院康复科， 河南 郑州 450018)

抑郁症是由各种原因引起的以抑郁为主要症状的精神神经障碍性疾病，临床上呈慢性进展，反复发作，主要表现思维迟缓、情绪低落、认知和意志力减退等症状[1]。目前由于社会竞争激烈，工作和生活节奏加快，以及慢性病的精神压力，使抑郁症患病率、复发率、自杀率及疾病负担均居高不下，已成为公共健康中的主要问题之一[2]。加强抑郁症的防治研究，探索更安全、有效的治疗方法及药物，具有重要的临床意义。

中风后抑郁症是脑卒中后并发的抑郁状态[3],其临床表现除脑神经功能障碍之外，逐渐出现反应迟钝、失眠、易疲劳、头晕头痛、心悸胸闷、口渴纳差、腹胀胃痛，健忘甚至痴呆等症状，严重影响脑卒中患者的生活质量和康复。中风后抑郁症的发病机制不清，近年研究显示，脑卒中后继发的神经结构损伤及功能障碍，是由免疫细胞活化介导的迟发性炎症反应介导的[4]。临床研究发现抑郁症患者中枢神经系统的促炎因子如白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等表达上升[5]。促炎因子、单胺类神经递质及下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴、神经营养因子紊乱和海马神经元损伤与重塑等多因素综合参与抑郁症的发生和发展[6-7]。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)具有多向分化潜能，可分化为神经干细胞，参与抗炎与组织修复,被广泛应用于脑卒中、神经退行性疾病和脊髓损伤等神经系统疾病的治疗[8]。

本课题组前期经文献研究和临床观察，发现中医药治疗中风后抑郁症的优势凸显[9]。本研究有中风后抑郁症患者60例，其中用加味丹栀逍遥散联合HUC-MSCs治疗30例，现将临床观察报道如下。

材 料 和 方 法

1 一般资料

60例中风后抑郁症患者来源于2015年2月～2018年2月河南中医药大学第二附属医院病房及门诊。60例患者按数字表法分为观察(observation)组和对照(control)组,各30例，观察组为加味丹栀逍遥散联合干细胞治疗组，女17例，男13例，病程平均(10.5±4.5)个月，年龄平均(64.3±5.2)岁。加味丹栀逍遥散联合氟西汀作为对照组，女16例，男14例，病程平均(11.6±3.5)个月，年龄平均(65.2±3.5)岁。2组在病程、性别和年龄上的差异无统计学显著性。患者均签订知情同意书。

1.1诊断标准 依据中华医学会第四届全国脑血管病学术会议修订的各类脑血管疾病诊断要点(1995年)[10]和《中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2010)》相关标准[11],参照《中华医学会精神病学分会·中国精神障碍分类与诊断标准·第三版》[12]，联合汉密尔顿抑郁量表-17(Hamilton’s depression scale-17，HAMD-17)[13]评分，测评抑郁程度。HAMD总分﹤8为无抑郁。入选病例16≥HAMD≥8为轻度抑郁；23≥HAMD≥17为中度抑郁；HAMD≥24为重度抑郁。

1.2纳入标准 (1)符合脑卒中抑郁障碍的诊断标准，依据头颅部电子计算机断层扫描(computed tomography，CT)或核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)检查；(2)符合抑郁症诊断标准，依据汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分≥8分，无失语及智能障碍，自愿配合诊断和治疗；(3)中医证候主要选取气郁化火型抑郁症，患者表现为急躁易怒，头晕头痛、失眠目赤，易疲劳、反应迟钝，健忘，口渴干苦，耳鸣心悸，胸闷肋痛，胃痛腹胀，纳差、便结尿黄，舌红苔黄，脉弦数；(4)近30 d 未接受中药、干细胞及相关制剂治疗；(5)年龄55～75岁；(6)受试者自愿参加，签署知情同意书，并经过河南中医药大学第二附属医院伦理委员会批准。

1.3排除标准 不入选者为:(1)既往有精神障碍及家族史阳性患者；(2)痴呆、耳聋及意识障碍患者；(3)身体其他部位的肿瘤、炎症、糖尿病患者；(4)合并消化系统、呼吸系统、泌尿系统、内分泌系统等疾病者；(5)不符合该纳入标准、依从性差而脱落的病例；(6)同时接受其它中药或西药治疗，混淆疗效判断者

2 人脐带间充质干细胞

HUC-MSCs购自OTWO Biotech(Shenzhen)Inc，质检报告显示乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、支原体、真菌和细菌等病原体检测均阴性。流式细胞术检测鉴定结果为CD34+2.47%、CD109+1.31%、CD29+98.1%、CD44+97.8%。

3 主要试剂和仪器

胎牛血清(Gibco)；DMEM高糖培养基(Thermo)；流式抗体FITC- CD34、FITC-CD44、FITC-CD29和FITC-CD109均购于BD。 1-15K高速冷冻离心机(Sigma)；FLC-3型超净工作台(哈尔滨市东联公司)；311型CO2培养箱(Thermo)；CKX41型倒置光学显微镜(OLYMPUS)；Millipak Express40去离子水仪(Milipore)；EPICS ALTRA流式细胞仪(Beckman Coulter)；InfiniteF50酶标仪(Thermo)；Lnicam型紫外分光光度计(Alpha)；-80 ℃低温冰箱(Thermo)等。

4 方法

4.1治疗方法 2组均根据《中国脑卒中康复治疗指南》[14]给予常规治疗原发病和康复锻炼。2组均口服加味丹栀逍遥散，中药皆为华润三九生产的中药配方颗粒。方药组成为柴胡15 g、白芍10 g、当归10 g、茯苓10 g(批号1405001W)、炒白术10 g(批号1407001W)、炙甘草5 g、炒山栀15 g、牡丹皮10 g、石菖蒲10 g、远志10 g、生姜10 g、薄荷5 g(批号均为1411001W)。加味丹栀逍遥散联合氟西汀组(对照组)：口服盐酸氟西汀胶囊(礼来苏州制药有限公司分装，批准文号国药准字J20130010)每粒20 mg(以氟西汀计)，每天1次，每次1粒，加服加味丹栀逍遥散，每天1付，早晚各半;4周为1疗程，2疗程后观察疗效。加味丹栀逍遥散联合干细胞组(观察组):口服加味丹栀逍遥散(同对照组)，另加人脐带间充质干细胞的移植治疗1次。治疗前、治疗第4周末分别查肝、肾功能及血、大便常规和心电图。

4.2人脐带间充质干细胞的移植 采用第3代～10代细胞，当细胞数量达到108/L时，用PBS冲洗2次后，滴加0.05%的胰酶液消化后加培养基终止消化，制成3×106/L的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示CD34和CD109均为阴性，CD44和CD29阳性率均>95%。移植治疗之前对细胞培养上清液进行检测，其中HIV病毒、乙肝病毒、支原体、细菌培养、真菌培养均阴性。经医院伦理委员会批准，移植组经外周较粗静脉给患者输注间充质干细胞(内含干细胞数4×107/L)悬液50 mL，以100 mL/h微泵匀速泵入1次。所有患者在输注过程未见不良反应，少部分患者输注细胞后当天晚上出现兴奋，不易入睡，自感潮热，但体温正常，3 d后无需处理自然缓解。

4.3HAMD评分 按照HAMD抑郁量表，在治疗前及治疗第4周末和第8周末各评分1次。治疗前及治疗第4周末查心电图、肝功能和肾功能。治疗前、后进行HAMD测试评分统计分析，比较2组的疗效。

4.4ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的浓度 治疗前、后，取患者肘静脉血于肝素抗凝管， 800 r/min离心5 min，取上层血清。人IL-1β、IL-6、TNF-α和BDNF的ELISA试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；5-HT和NE均为ADL公司产品。按说明书进行检测。在450 nm处测吸光度(A)值，绘制标准曲线，求IL-1β、IL-6、TNF-α、BDNF、5-HT、NE的浓度。

4.5疗效评价标准 参照国家中医药管理局公布的1994年《中医病症诊断疗效标准》[15]和HAMD量表评分。(1)痊愈：HAMD<8分，症状消失，情绪恢复正常；(2)显效：HAMD评分8～10分，主要症状明显好转，情绪基本稳定；(3)有效：HAMD评分较治疗前降低10～18分，部分症状好转，情绪稍有改善；(4)无效：HAMD评分与治疗前无差异，症状及情绪均无改善。

5 统计学处理

用SPSS 18.0统计软件进行数据处理和统计分析。计数资料用卡方检验，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05有统计学意义。

结 果

1 两组总有效率的比较

与对照组比较，观察组总有效率显著增高(P<0.05)，见表1。

表1 观察组与对照组总有效率的比较

2 治疗前、后2组HAMD评分的比较

治疗前2组患者HAMD评分的差异无统计学显著性(P>0.05)。与同组治疗前比较，2组治疗4周和8周后的HAMD评分均有显著降低(P<0.05)；治疗4周和8周后，观察组的HAMD评分均显著低于同期对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组治疗前、后HAMD评分的比较

3 治疗8周后中风后抑郁症患者血清TNF-α、IL-1β、IL-6、5-HT、NE和BDNF水平的变化

治疗8周后，与组内治疗前比较，血清的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均降低(P<0.05)；治疗8周后，观察组血清的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均比同期对照组显著降低(P<0.05)，见表3。

治疗8周后，与组内治疗前比较，血清的5-HT、NE和BDNF水平均显著增高(P<0.05)；治疗后，观察组血清的NE、5-HT和BDNF水平均显著高于同期对照组(P<0.05)，见表3。

表3 2组中风后抑郁症患者血清TNF-α、IL-1β、IL-6、5-HT、NE和BDNF水平的比较

4 不良反应

对照组主要不良反应包括视物模糊、头晕头痛、血压偏高、心悸、食欲减退、口干、恶心、呕吐和便秘等。对照组发生9例次。观察组干细胞移植后潮热，但体温正常，3天后潮热消失，未见其他异常，饮食、睡眠均佳。

讨 论

抑郁症与社会环境、心理应激和遗传等因素密切相关，其中低强度、长期的应激事件是引发抑郁的主要原因。

抑郁症的病理生理机制复杂，其中细胞因子在抑郁症发病机制中起重要作用。抑郁症患者外周血和脑脊液中细胞因子的水平高于普通人群。如TNF-α、 IL-6、IL-1β和C反应蛋白等细胞因子参与抑郁症的发病[16]。抗炎药物能有效改善抑郁症患者的症状，随抑郁症状的好转，患者血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平相应下降[17]。本研究结果显示，治疗8周后，与同组治疗前比较，血清TNF-α、IL-1β和IL-6均显著降低，说明TNF-α、IL-1β和IL-6均参与中风后抑郁症的发生，2组均有抗炎作用。研究表明脐带造血干细胞可通过抑制促炎因子的表达，包括TNF-α和IL-6等细胞因子，发挥抑制炎症与神经保护的作用[18]。本研究显示，患者治疗8周后，观察组血清TNF-α、IL-1β和IL-6均显著低于对照组，提示加味丹栀逍遥散联合干细胞有抗炎作用，且优于加味丹栀逍遥散联合氟西汀。

细胞因子能激活脑内胶质细胞产生更多的细胞因子，引起海马神经元凋亡增加、再生减少及认知功能损害[19]。海马 CA3 区对应激极度敏感，慢性应激导致海马CA3区锥体细胞受损，神经元体积显著缩小、数目减少，海马萎缩；同时伴有突触的减少，功能降低。长期应用抗抑郁药可促进神经元再生，逆转海马萎缩和损伤[20]。BDNF可调节神经干细胞的生长、分化，树突和轴突的生长及突触的形成，可当作神经可塑性的标志。脑中风直接损害了神经元及其传导通路，突触间的单胺类递质NE和5-HT减少，抑郁症患者的血清BDNF水平较正常显著下降[21]。经典抗抑郁药的研发思路主要在增加单胺类递质对突触后膜的响应上[22]。氟西汀为选择性5-HT再摄取抑制剂，疗效较为肯定，是目前应用最为广泛的抗抑郁剂，但其不良反应包括视物模糊、头晕头痛、心悸、高血压、口干、食欲减退、恶心呕吐和便秘等。

干细胞是一类具有多向分化潜能的“种子”细胞。干细胞技术及其产品在临床用于治疗神经系统疾病如脑瘫、脊髓损伤、老年痴呆、帕金森综合症，取得显著疗效[23]。近期研究表明，干细胞治疗脑卒中的机制不仅在于促进海马齿状回和脑室下区神经干细胞的生存、分化与增殖以替代与修复受损组织，还可通过分泌营养因子，减少内源性细胞凋亡，降低脑卒中后的组织损伤，促进内源性血管再生，改善脑供血等[24]。

抑郁症属中医学的情志病范畴，其主要病机为肝失疏泄，气机郁滞，气郁则湿不化，湿则生痰，痰凝气滞，常见症状有睡眠障碍、头痛头晕、食欲减退、乏力、消瘦、性功能减退等。在临床上抑郁症的证候分为气郁化火、肝气郁结、气滞痰郁、忧郁伤神证、阴虚火旺证、心脾两虚证等。本文选取的中风后抑郁症患者，因自责自罪、情志抑郁，过度忧思、致肝郁气滞、气机升降失调，气郁日久而致血郁，进而化火。患者表现为性情急躁易怒，头痛目赤，口干苦，耳鸣，胸闷肋痛，便结尿黄，舌红苔黄，脉弦数，属于气郁化火证候。宜采用理气解郁、清肝泻火、调和气血以及整体调节脏腑功能的治法方药。用丹栀逍遥散加石菖蒲、远志，治疗气郁化火型抑郁症。丹栀逍遥散又名加味逍遥散，是在宋代《太平惠民和剂局方》逍遥散的基础上加丹皮、栀子组成，出自明代薛己的《内科摘要》。丹栀逍遥散是中医调治情志活动异常的经典名方，尤其适用于肝郁化热证型，疗效显著[25]。因中风后肝郁血虚，久之生热化火，用逍遥散已不足以平其火热，故加丹皮以清血中之伏火，炒山栀善清肝热，并导热下行。加味丹栀逍遥散由柴胡、白芍、当归、茯苓、炒白术、生姜、薄荷、炒山栀、牡丹皮、炙甘草、石菖蒲和远志等药物组成。方中柴胡疏肝解郁、条达肝气，为君药；白芍养血敛阴、柔肝缓急，当归养血和血，为臣药；茯苓利饮化痰，白术、甘草健脾益气、气血运化、缓肝之急，石菖蒲开窍醒神、宁神益志，远志开窍益智、利气安神、定元神而助疏肝解郁，为佐药；生姜温运和中、辛以散结，薄荷疏散郁遏之气、透达肝经郁热，炒山栀善清肝热、导热下行，丹皮清血中之火，为使药。诸药合用，全方共奏疏肝解郁、行气散结,降逆化痰、养血健脾、健脑益智之功效。疏散清补并进，使肝郁疏散、化火清热、脾虚得健、心神得宁而起到治疗作用。

本研究结果显示，与同组治疗前比较，治疗后2组患者血清5-HT、NE和BDNF均显著增高，HAMD评分显著降低，说明2组方法均有效。治疗8周后，观察组血清5-HT和BDNF均显著高于对照组，HAMD评分显著低于对照组，提示在上调5-HT和BDNF水平方面，加味丹栀逍遥散联合干细胞的抗抑郁效果优于加味丹栀逍遥散联合氟西汀，其机制可能与干细胞抗炎、增加单胺类神经递质释放、刺激脑内神经营养因子的分泌、促进神经再生与修复有关。但其具体的分子机制仍有待深入探讨。