PI3K/Akt/GSK-3β通路介导ABC转运蛋白调控人结肠癌HCT-15细胞多药耐药*

袁亚男， 严晓丽， 黄艳洁， 杜梦楠， 郑纪宁

(承德医学院病理学与病理生理学教研室， 河北 承德 067000)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，且发病率有逐年升高趋势。据2018年全球肿瘤统计报告显示，结直肠癌在恶性肿瘤中的发病率位列第4位，但死亡率却高居第2位[1]。在我国，结直肠癌在男性恶性肿瘤中的发病率位列第4，在女性则位列第3位[2]。手术治疗是早期结直肠癌的根治方法，而中晚期结直肠癌患者则依赖于化疗、放疗以提高5年生存率[3]。

目前临床上改善结直肠癌预后的主要化疗药物以奥沙利铂为主，但仍有半数以上的患者疗效不显著，肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是导致化疗失败的主要原因之一。克服结直肠癌的MDR，提高化疗效果是目前亟待解决的问题。产生MDR的机制复杂多样，其中以转运蛋白的活化最为主要。本课题所研究的转运蛋白包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP-2)同属于ABC家族，其中P-gp由ABCB1基因编码，MRP-2由ABCC2基因编码。目前研究发现，作为磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt信号通路下游靶因子的糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)参与肿瘤细胞的发生与发展，是肿瘤细胞的关键调节因子，但在结直肠癌细胞中关于GSK-3β与多药耐药的关系尚未见报道。本课题通过应用不同抑制剂改变GSK-3β的磷酸化状态，监测多药耐药相关蛋白的表达变化及其对奥沙利铂敏感性的影响，旨在探讨PI3K/Akt信号通路的下游靶因子GSK-3β与ABC转运蛋白及结直肠癌多药耐药的关系。

材 料 和 方 法

1 材料

人结肠癌HCT-15细胞购于广州吉妮欧生物有限公司。细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)购自上海同仁化工有限公司；PI3K/Akt信号通路抑制剂HY-13898及GSK-3β抑制剂HY-19807购自MCE；奥沙利铂购自深圳海王药业有限公司；总RNA抽提试剂盒和定量PCR试剂盒购自天根生化科技有限公司；GAPDH和ABCB1、ABCC2基因上下游引物和探针购自TaKaRa；RIPA及PMSF购自Solarbio；BCA蛋白质定量试剂购自碧云天生物科技有限公司；抗P-gp和MRP-2单克隆抗体购于Cell Signaling；抗Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β-Ser9单克隆抗体购自博奥森生物有限公司。NanoDrop 2000超微量分光光度仪购自Thermo，CFX96定量PCR仪购自Bio-Rad，酶标仪购自Thermo，化学发光仪购自Tanon。

2 方法

2.1细胞培养 结肠癌细胞系HCT-15用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液于37 ℃、5% CO2的条件下培养。实验选用对数生长期细胞，分为3组:对照(control)组:HCT-15细胞+DMSO；HY-19807组:HCT-15细胞+GSK-3β抑制剂(HY-19807溶于DMSO，实验终浓度为 40 μmol/L，作用细胞2 h)；HY-13898 组:HCT-15细胞+PI3K/Akt信号通路抑制剂(HY-13898溶于DMSO，实验终浓度为 30 μmol/L，作用细胞24 h)。

2.2Western blot检测蛋白水平 取3个实验组处于对数生长期细胞，用PBS 洗涤细胞 3 次，加入细胞裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶ 1)，在冰上静置30 min。细胞刮子刮取细胞并移至EP管内，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清至另一EP管内。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，并取各组40 μg蛋白上样。细胞蛋白通过10% SDS-PAGE分离，并转移到 PVDF膜上。在室温下，PVDF 膜在封闭缓冲液中封闭 1～2 h，孵育 I 抗缓冲液(GSK-3β 1 ∶1 000； p-GSK3β-Ser9 1 ∶1 000； Akt 1 ∶1 000；p-Akt 1 ∶1 000； P-gp 1 ∶1 000；MRP-2 1 ∶1 000)，4 ℃过夜。次日用TBST洗膜3次,每次10 min，室温下孵育HRP标记的 II 抗缓冲液(1 ∶1 000)2 h，TBST洗膜3次,每次10 min。 PVDF 膜浸泡于1 ∶1比例的 ECL 发光液2～3 min，使用天能分子成像仪激发和采集目的条带，借助ImageJ 分析软件定量目的条带。

2.3CCK-8法检测细胞生长情况 取3个实验组的对数生长期细胞制成细胞悬液，以每孔100 μL接种于96孔板中，并调整每孔细胞数约6×103个。待4 h后细胞贴壁，分别加入含有不同浓度奥沙利铂的培养基100 μL，每孔设4个复孔，继续放置在37 ℃、5% CO2的孵箱内培养。24 h 后每孔内加入含有10 μL CCK-8的RPMI-1640培养基100 μL，继续孵育3 h后，在450 nm波长下用酶标仪测量每孔的吸光度(A)值。用细胞的存活曲线计算达到50%细胞生长抑制的奥沙利铂的浓度，计算细胞的生长抑制率、耐药指数(resistance index，RI)。计算公式：生长抑制率(%)=(A对照组平均值-A实验组平均值)/(A对照组平均值-A空白对照组平均值)×100%；RI=实验组细胞的IC50/对照组细胞的IC50。实验重复3次，取平均值。

2.4RT-qPCR法检测mRNA 的表达 取3个实验分组中处于对数生长期的细胞加入TRIzol置冰上15 min，然后12 000×g、4 ℃离心15 min，小心取上层清液，按照RNA提取步骤依次加入1/5体积的氯仿及等体积异丙醇。将提取的RNA用Nanodrop 2000分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及A260/A280的数值，且A260/A280在1.8～2.1之间为纯度符合要求。放于-80 ℃保存备用。按照反转录试剂盒操作步骤将提取的RNA反转录为cDNA。总反应体系20 μL，包含2×SYBR Master Mix标准混合液10 μL，上、下游引物各1 μL，标本2 μL，去RNase水6 μL。PCR条件为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 5s、60 ℃ 30s、72 ℃ 20s，共40个循环，所有标本检测3次。用内参照GAPDH标准化结果，结果采用靶基因与内参照GAPDH浓度的比值表示。采用相对定量方法(2-ΔΔCt法)对定量结果进行比较分析。各基因引物序列见表1。

表1 RT-qPCR实验的各基因引物序列

2.5细胞周期分布的检测 收集对数生长期的各组细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞2次。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释成细胞悬液，加入预冷的70%乙醇，4 ℃固定过夜，离心，PBS 洗涤，加入500 μL PI染液，室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。

3 统计学处理

数据采用 SPSS 19.0 软件分析，计量资料实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多个样本均数间的比较先进行方差齐性检验，方差齐时进行单因素方差分析，相关性分析采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Western blot实验结果

Western blot检测结果显示，将HY-19807作用于人结肠癌HCT-15细胞后，p-GSK-3β-Ser9、P-gp和MRP-2的表达较未用药的HCT-15组明显升高(P<0.05)，GSK-3β上游的Akt及p-Akt的蛋白水平变化不明显(P>0.05)；而将HY-13898作用于HCT-15细胞后，p-GSK3β-Ser9和p-Akt的蛋白水平降低(P<0.01)，P-gp和MRP-2蛋白的相对表达量均明显低于对照组(P<0.01)；总GSK-3β在2个实验组中的水平变化不明显，差异无统计学显著性(P>0.05)，见图1。提示HY19807能够通过促进磷酸化GSK-3β-Ser9增加HCT-15细胞ABC转运蛋白的表达，而HY13898可以通过抑制GSK-3β-Ser9磷酸化降低ABC转运蛋白的表达，且p-GSK3β-Ser9与P-gp和MRP-2的蛋白水平存在正相关。

Figure 1.The results of Western blot for determining the protein levels of total GSK-3β, p-GSK-3β-Ser9, Akt, p-Akt, MRP2 and P-gp in the HCT-15 cells after treated with different inhibitor.Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2 HCT-15细胞应用不同抑制剂后对奥沙利铂敏感性的影响

应用HY-19807作用于人结肠癌HCT-15细胞后，奥沙利铂对HCT-15细胞的半数抑制浓度(IC50)由(19.83±0.80) mg/L升至(27.15±1.57)mg/L，耐药指数为1.36(P<0.01)。HY-13898作用于人结肠癌HCT-15细胞阻断PI3K/Akt信号通路激活后，奥沙利铂对HCT-15细胞的半数抑制浓度(IC50)由(19.83±0.80)mg/L降至(9.93±1.77)mg/L，耐药指数为0.5(P<0.01)，见图2。提示HY-19807增加p-GSK-3β-Ser9的水平后可以降低HCT-15细胞对奥沙利铂的敏感性，而HY-13898使GSK3β-Ser9去磷酸化后可以增强HCT-15细胞对奥沙利铂的敏感性。

Figure 2.The effect of different inhibitors on the cell viability (A) and the changes of IC50(B) in the HCT-15 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

3 RT-qPCR实验结果

RT-qPCR检测结果显示，将HY-19807作用于人结肠癌HCT-15细胞后，ABCB1和ABCC2的mRNA表达较对照组明显升高(P<0.01)；将HY-13898作用于HCT-15细胞后，ABCB1和ABCC2的mRNA相对表达量均明显低于对照组(P<0.05)，见图3。提示HY-19807使GSK3β-Ser9位点磷酸化增加，可以促进ABC转运蛋白mRNA的表达；相反，HY-13898使GSK3β-Ser9位点去磷酸化后可抑制ABC转运蛋白mRNA的表达。

Figure 3.The relative mRNA expression of ABCC2 and ABCB1 in the HCT-15 cells after treated with different inhibitors. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.

4 细胞周期分布的变化

经流式细胞术分析，control组G1期细胞占比(59.61±0.73)%，S期细胞占比(23.38±0.74)%，HCT-15细胞经HY-19807处理后与对照组相比G1期细胞的百分率为(45.69±0.96)%，明显减少(P<0.01)，同时S期细胞的百分率为(39.77±0.92)%，显著增加(P<0.01)，表明HY-19807可促使 HCT-15 细胞由G1期向S期过渡，促进细胞增殖。用HY-13898处理HCT-15细胞后，G1期的细胞百分率为(84.17±1.35)%，明显增加(P<0.01)，同时S期的细胞百分率为(6.90±0.59)%，显著减少(P<0.01)，表明 HY-13898可阻止HCT-15细胞由G1期向S期过渡，细胞增殖受到抑制，见图4。

Figure 4.The effects of different inhibitors on the cell cycle distribution in the HCT-15 cells. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs control group.

讨 论

结直肠癌的发病率及死亡率一直呈上升趋势，化疗是治疗结直肠癌的重要辅助手段。奥沙利铂作为临床上广泛应用的铂类化疗药，因为肿瘤细胞多药耐药的出现严重影响其化疗效果。国内外学者多方面研究发现，奥沙利铂导致多药耐药的主要原因之一是细胞内转运蛋白的活化，致使药物外排作用增加，降低细胞内的有效药物浓度。本课题研究的2种转运蛋白P-gp和MRP2同属于ABC转运蛋白家族，P-gp是由1 280个氨基酸组成的分子质量为170 kD的单链跨膜糖蛋白，MRP是由1 531个氨基酸组成的分子质量为190 kD的多药耐药相关蛋白，两者能够利用ATP水解的能量，将疏水亲脂的化疗药物主动排出细胞外，降低细胞内药物蓄积，从而使肿瘤细胞产生多药耐药。P-gp可以直接将药物由细胞内排出，使得细胞免受化疗药物的毒性作用。而MRP需要谷胱甘肽与药物的共价结合来确保转运的实现[4-5]。越来越多的证据表明这两种转运蛋白(P-gp和MRP2)的活化是由于PI3K/Akt通路的激活所致[6-7]。

PI3K/Akt信号传导通路是一条酪氨酸激酶级联信号传导通路，是细胞生存通路之一。PI3K/Akt通路激活使Akt发生磷酸化而激活，活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、caspase-9、NF-κB、GSK-3β、FKHR、mTOR、FKHR和p27 Kip1等。PI3K/Akt信号通路活化后不仅能够促进细胞增殖与侵袭，Ma等[8]研究发现PI3K/Akt通路在介导人白血病多药耐药方面发挥重要作用。众多学者在胃癌[9]、肺癌[10]、人乳腺癌[11]和肝癌[12]等多种肿瘤细胞中证实PI3K/Akt通路能够调控ABC转运蛋白的表达参与肿瘤细胞多药耐药，但具体机制尚不清楚。Sui等[6]研究发现通过抑制PI3K/Akt通路下游NF-κB磷酸化能够下调P-gp的表达，逆转人结肠癌多药耐药。

GSK-3β是PI3K/Akt通路下游靶因子之一，PI3K/Akt通路激活后可使GSK-3β丝氨酸9位点发生磷酸化，从而抑制GSK-3β的活性。GSK-3β作为PI3K/Akt通路下游的靶因子，在人类多种肿瘤细胞中发挥着重要的作用。有研究表明，在前列腺癌[13]及胰腺癌[14]中GSK-3β能够促进肿瘤细胞的增殖与转移。与此同时，在胆管癌细胞[15]和乳腺癌[16]中，GSK-3β激活后能够降低ABC转运蛋白的表达并逆转肿瘤细胞的多药耐药。通过前人的研究发现PI3K/Akt通路的激活能够导致多药耐药的发生，且GSK-3β与肿瘤细胞增殖与耐药之间存在密切关系，但在直结肠癌中，PI3K/Akt通路是否通过下游靶因子GSK-3β途径调控ABC转运蛋白的表达来参与多药耐药在大肠癌细胞中的作用未见报道。

本课题研究结果显示，应用GSK-3β抑制剂HY-19807后，奥沙利铂对HCT-15细胞的半数抑制浓度(IC50)由(19.83±0.80)mg/L升至(27.15±1.57)mg/L。应用PI3K/Akt通路抑制剂HY-13898后，奥沙利铂对HCT-15细胞的IC50由(19.83±0.80)mg/L降至(9.93±1.77)mg/L，说明抑制GSK-3β活性后能够增加细胞的耐药性，阻断PI3K/Akt信号通路,增强GSK-3β活性后能降低细胞的耐药性。进一步研究发现，HY-19807作用于HCT-15细胞后，p-GSK-3β-Ser9、P-gp及MRP2的表达增加，而HY-13898作用于HCT-15细胞后，Akt表达增加，p-Akt、p-GSK-3β-Ser9、P-gp及MRP2的表达降低，两种抑制剂对总GSK-3β表达无影响。RT-qPCR检测结果显示，应用HY-19807后，HCT-15细胞ABCB1和ABCC2的mRNA表达增加，应用HY-13898后，ABCB1和ABCC2的mRNA表达降低。提示HY-19807抑制GSK-3β活性后，能够增加HCT-15细胞中P-gp、MRP2的蛋白表达及ABCB1和ABCC2的mRNA表达，导致药物外排作用增加，细胞内药物浓度降低，减弱肿瘤细胞对奥沙利铂的化疗敏感性。HY-13898抑制PI3K/Akt信号通路，使GSK3β去磷酸化而激活，能够降低HCT-15细胞中p-Akt、p-GSK-3β-Ser9、P-gp及MRP2的蛋白表达，降低ABCB1和ABCC2的mRNA表达，药物外排作用减弱，细胞内药物浓度增加，增强肿瘤细胞对奥沙利铂的化疗敏感性。GSK-3β作为PI3K/Akt信号通路下游的靶因子，PI3K/Akt信号通路激活后磷酸化GSK-3β-Ser9位点，使GSK-3β活性降低，P-gp及MRP2表达增加。抑制PI3K/Akt信号通路能够使GSK-3β-Ser9去磷酸化，GSK-3β活性增强，P-gp及MRP2表达减少。以上实验结果表明在HCT-15细胞中P-gp及MRP2的表达是通过PI3K/Akt信号通路下游的GSK-3β途径调控的，直接参与结直肠癌细胞的的多药耐药。

本课题也证实了通过改变GSK-3β-Ser9的磷酸化表达同样能够对HCT-15细胞的增殖起到调控作用。应用GSK-3β抑制剂HY-19807使GSK3β活性受到抑制后，HCT-15细胞G1期细胞百分率明显减少，S期细胞百分率显著增加，表明GSK-3β抑制剂可促使 HCT-15 细胞由G1期向S期转变，促进细胞增殖。而应用PI3K/Akt通路抑制剂HY-13898使GSK-3β激活后，出现G1期细胞百分率明显增加，同时S期细胞百分率显著减少，表明 PI3K/Akt通路抑制剂可以阻止HCT-15细胞由G1期转变为S期，细胞增殖受到抑制。考虑PI3K/Akt通路可以通过GSK-3β途径调控HCT-15细胞的细胞周期，影响细胞的增殖，进而影响化疗药物在临床治疗中的效果。

直结肠癌的多药耐药机制上存在复杂性和多因素性，GSK-3β如何调控ABC转运蛋白表达的机制尚不清楚。GSK-3β作为激酶能够磷酸化多种底物，GSK-3β是否具有直接磷酸化ABC转运蛋白的功能还需要进一步试验证实。本研究仅在细胞水平进行研究及实验，且细胞系单一，实验结果存在一定的局限性，后续研究可在多种细胞系间做比较，并收集临床标本开展组织学实验，从而更全面地研究GSK-3β在大肠癌多药耐药中的作用。如能明确GSK-3β与ABC转运蛋白之间存在直接相关性，则可将GSK-3β作为调控大肠癌细胞化疗敏感性的靶基因，临床上就可通过抑制大肠癌患者GSK-3β-Ser9位点的磷酸化表达来提高细胞的化疗敏感性。