炎症性肠病患者CXCR1、IL-17 的表达及其意义

蔡清红 马松炎 钟俊锋

广东省惠州市第三人民医院消化内科，广东惠州 516000

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是指一类病因不明的特发性慢性肠道炎症性疾病，多累及回肠、结直肠部位，主要包括两个独立的疾病：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）、克罗恩病（Crohn disease，CD）[1]。该病主要临床特征包括腹痛、腹泻、黏液血便等[2]。近年来，我国IBD 发病率呈不断上升趋势，且易反复性发作，对患者生活及工作造成严重不良影响[3]。据报道，该病可由疲劳、饮食失衡以及精神刺激和免疫异常等因素诱发，但多数患者为受到免疫异常影响而发病，患者主要表现出炎性细胞浸润类型黏膜炎症，并且有多种趋化因子以及其受体共同参与该病发展[4-5]。因此，深入探讨IBD 发病机制，并寻找出和该病发病存在密切联系的标志物，进而为其治疗提供可靠新靶点，以提高临床IBD 治疗效果，是当前研究工作的重点。有学者指出[6-7]，CXC 趋化因子受体1（CXC chemokine receptor1，CXCR1）和白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）均参与IBD 发病，其中CXCR1属于促炎多肽性细胞因子有关超家族的成员之一，其通常由造血微环境所含的基质细胞所分泌，能够激活及趋化机体内白细胞的移动。而IL-17 主要由Th17细胞所分泌，可以激活和募集中性粒细胞不断聚集在炎症区域，同时引起或扩大机体的炎性反应。二者在IBD 中的具体表达作用仍需进一步分析。本研究通过分析CXCR1 和IL-17 在炎症性肠病患者中的表达及其意义，旨在为临床更好地治疗IBD 提供数据支持，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

2016 年1 月～2017 年12 月惠州市第三人民医院（以下简称“我院”）收治的80 例IBD 患者进行回顾性分析。入选标准：①所有患者的诊断均符合中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组在2012 年时制定的IBD 诊断及治疗共识意见[8]；②年龄≥18 岁；③近6 个月内就诊次数＞3 次；④全部患者均处于疾病的活动期。排除标准：①合并其他种类的消化系统性疾病者；②有恶性肿瘤者；③有血液疾病者；④有其他严重的内科疾病者。IBD 患者中，UC 患者70 例，纳入UC 组，其中男42 例，女28 例；年龄30～56 岁，平均（42.37±2.14）岁；病程3～7 个月，平均（4.30±1.47）个月。CD 患者10 例，纳入CD 组，其中男7 例，女3 例；年龄32～57 岁，平均（42.41±2.03）岁；病程3～6 个月，平均（4.10±1.39）个月。另选同期在医院进行结肠镜检查的健康志愿者50 例纳入对照组，其中男36 例，女14 例；年龄31～55 岁，平均（42.50±2.12）岁。三组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂 cDNA 逆转录试剂盒（Fermentas 公司，生产批号：20150423）；real time PCR 试剂盒（Takara公司，生产批号：20151212）；CXCR1 兔抗人的多克隆抗体（Santa Cruz 公司，生产批号：20150129）；羊抗兔IgG（H+L）-HRP（天津三箭生物技术有限公司，生产批号：20150611）。

1.2.2 检测各组血清IL-17 及CXCR1 mRNA 的表达抽取各组的空腹静脉血约6 mL，用real time PCR 测定IL-17 及CXCR1 mRNA 的表达情况，相关引物序列均由Takara 公司提供。通过Trizol 法对静脉血的RNA 进行提取，取RNA 产物约2 μL，用M-MLV逆转录酶常规合成cDNA，再由real time PCR 仪（CFX Connect，BioRad）实施荧光定量扩增，得到CT 值，并用2-△△Ct法进行计算。其中PCR 的反应参数为：预变性为95℃下5 min，变性为95℃下30 s，退火为56～62℃下30 s，延伸为72℃下1 min，共30 个循环，再给予10 min 72℃的终延伸。IL-17 引物序列：正向引物为：5′-TCGTCCACGGGTCCTCTCTCCC-3′；反向引物：5′-GTACAGTTTTGTAAACGATGG-3′。CXCR1 引物序列：正向引物：5′-CCCGTTGGATTACCAGACGAACG-3′；反向引物为：5′-CGGAAACTCTGTCCTCATGTCATGG-3′。将β-actin 作为内对照。

1.2.3 检测各组肠黏膜IL-17 及CXCR1 mRNA 的表达 将提取的各组肠黏膜组织用real time PCR 法测定IL-17 及CXCR1 mRNA 表达，其中肠黏膜组织均取自结肠镜的活检组织，对照组取志愿者正常肠段的组织。检测步骤同“1.2.2”，相关引物序列均由Takara公司提供，严格根据说明书的要求逐步实施。

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测肠黏膜组织CXCR1 蛋白的表达 通过蛋白免疫印迹法进行测定操作，将各组的20 mg 肠黏膜组织在研磨并粉碎之后添加100 μL冷蛋白裂解液（①50 mmol/L 的Tris-HCL；②pH 为7.5；③150 mmol/L 的NaCl；④1%的NP-40；⑤0.1%的SDS；⑥对每100 μL 的裂解液添加1 μL 100 mmol/L的PMSF 液），待其充分裂解之后给予3 min 4℃下10 000 r/min 的离心，离心半径12.5 cm，提取上清液并检测蛋白浓度。将40 μg 蛋白同上样缓冲液进行混合，并煮沸5 min，给予SDS-PAGE，再电转移到PVDF膜，用5%BSA 配制的脱脂牛奶予以封闭，再添加二抗行室温孵育2 h，用TBST 缓冲液清洗3 次，最后用增强化学发光法进行曝光显影，并应用Image J 软件进行蛋白质定量分析。

1.3 观察指标

比较各组血清及肠黏膜IL-17 及CXCR1mRNA表达水平，各组肠黏膜的CXCR1 蛋白表达水平，分析患者血清及肠黏膜IL-17 与CXCR1 表达的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，其中计数资料采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（）表示；多组间比较采用方差分析，组间计量资料两两比较采用LSD-t 检验。采用Spearman 进行相关性分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清IL-17 及CXCR1 mRNA 表达水平比较

与对照组比较，UC 组及CD 组血清IL-17 mRNA表达水平升高（均P ＜0.05），但UC 组与CD 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；各组血清CXCR1 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 各组血清IL-17 mRNA 及CXCR1 mRNA 表达比较（）

表1 各组血清IL-17 mRNA 及CXCR1 mRNA 表达比较（）

注：与对照组比较，*P ＜0.05。IL-17：白细胞介素-17；CXCR1：CXC趋化因子受体1

2.2 各组肠黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表达及CXCR1 蛋白表达水平比较

与对照组比较，UC 组及CD 组肠黏膜IL-17 mRNA、CXCR1 mRNA 及CXCR1 蛋白表达水平升高（均P ＜0.05）；与CD 组比较，UC 组肠黏膜CXCR1 mRNA 及CXCR1 蛋白表达水平升高（P ＜0.05），但UC 组与CD 组肠黏膜IL-17 mRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 各组肠黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表达及CXCR1 蛋白表达水平比较（）

表2 各组肠黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表达及CXCR1 蛋白表达水平比较（）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与CD 组比较，#P ＜0.05。IL-17：白细胞介素-17；CXCR1：CXC 趋化因子受体1

2.3 患者血清及肠黏膜IL-17 mRNA 与CXCR1 mRNA 表达的相关性分析

Spearman 相关性分析发现，患者血清及肠黏膜IL-17 与CXCR1 表达呈正相关（r=0.435、0.505，P=0.043、0.038）。

3 讨论

临床将IBD 分为UC 以及CD 两种类型，其中UC 为结肠黏膜层以及黏膜下层等出现的连续性炎性反应，其多数首先累及患者直肠，而后不断向全结肠蔓延。而CD 则是累及整个消化道，属于非连续性质全层炎症，最易累及位置包括末端回肠以及结肠、肛周等。目前临床对于该病发病机制以及治病因素等均无确切定论，有学者指出，该病的发病机制较复杂，主要是由环境、遗传以及感染和免疫等多种因素共同导致[9-12]。同时，临床研究显示，肠道黏膜自身免疫系统发生异常反应，并引发系列炎性反应，是IBD 患者发病的关键[13-14]。因此，IBD 发病与免疫功能异常之间存在直接联系，使得有关肠道免疫功能紊乱问题的研究成为当前IBD 疾病研究的重点。

本研究发现，与对照组比较，UC 组及CD 组血清IL-17 mRNA 表达水平更高（P ＜0.05），但UC 组与CD 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；而UC 组及CD 组肠黏膜IL-17 及CXCR1 mRNA 表达水平与对照组比较明显升高，且UC 组肠黏膜CXCR1 mRNA 表达水平较CD 组明显更高（P ＜0.05），但IL-17 mRNA差异无统计学意义（P ＞0.05）。这与胡梅等[15]的报道结果一致。提示IL-17 及CXCR1 均可能参与到IBD的发病过程中，但二者的作用机制有所差异。CXCR1能够特异性地结合IL-17，并介导相应的中性粒细胞趋化和磷脂酶D 的活化，及超氧化物的形成，在IBD中重点参与到UC 的发病过程当中，并与UC 的活动性紧密相关[16]。而IL-17 则主要可能是通过促进白细胞释放过量的化学因子引起组织炎症的发生，最终强化了肠道内的炎性反应而导致IBD 的形成[17]。同时，本文还发现，与对照组比较，UC 组及CD 组肠黏膜CXCR1 蛋白表达水平升高（P ＜0.05），且UC 组较CD组更高（P ＜0.05），再次提示了CXCR1 蛋白虽然可参与到IBD 的发病，但以UC 为主。进一步分析发现，患者血清及肠黏膜IL-17 与CXCR1 mRNA 表达呈正相关。这提示了炎症因子与趋化因子之间存在着一定程度的联系，主要由于多种炎症细胞不断向肠道转移，并且释放出大量趋化因子。以上炎症细胞以及趋化因子等共同参与IBD 发生，并造成炎症损伤[18]。趋化因子是指一种通过组织细胞以及炎症细胞合成并分泌，具备对炎症细胞进行趋化募集以及活化等功能的蛋白质，其能够和相应受体相结合，并诱导炎症细胞不断趋化游走，介导其向发生炎症位置聚集，并且活化[19]。CXC为趋化因子一个典型亚家族，与其相结合的受体则是CXC 受体，CXCR1 为其中一个类型。CXC 与CXCR 可以互相结合并发挥出一定生物学功能，且对炎性反应产生一定作用[20-21]。IL-17 则具备较高的炎症活性，其可通过引起下游多类细胞因子及趋化因子表达，不断招募机体的中性粒细胞和巨噬细胞迁移至炎症部位区域，从而产生组织损伤，而肠道内的微生物及局部性的细胞因子微环境则共同促使了IL-17 的表达[22]。因此，监测CXCR1 和IL-17 有利于更好地辅助治疗IBD。这在Verstockt 等[23]的报道中也有类似的结论可加以佐证。

综上所述，IBD 患者CXCR1 和IL-17 呈高表达，且患者血清及肠黏膜的IL-17 与CXCR1 表达呈正相关，临床上可考虑监测CXCR1 和IL-17 水平，从而更好地辅助治疗IBD。