血液来源表皮葡萄球菌生物被膜形成能力及agr 基因多态性调查

胡洪华 喻 华 黄文芳 杨永长

四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川成都 610072

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）是一种常定居于人体皮肤表面和黏膜表面的共生菌，通常被认为是非致病菌[1]。近年来，各种植入性医用材料等在临床应用日益增多，SE 已成为院内感染的重要致病菌。有统计数据显示，美国每年用于治疗SE 引起的血流感染的费用约20 亿美元[2]。SE 的最主要致病因素是形成生物被膜，生物被膜的形成受多基因的调节，附属基因调节因子（accessory gene regulator，agr）是SE 生物被膜形成过程中重要的调控因子[3]。SE 形成生物被膜，导致持续性和反复性感染，已引起临床高度重视。本研究以临床分离血液来源SE 为研究对象，分析其agr 基因多态性和生物被膜的形成能力。

1 材料与方法

1.1 菌株收集

SE 来自于2012 年3 月～2015 年2 月四川省人民医院住院患者分离的血液来源菌株，无重复菌株，所有菌株采用全自动微生物分析系统VITEK 2.0 鉴定。

1.2 仪器和试剂

PCR 反应试剂盒（北京康为世纪公司，批号：40111）；DNA 提取液（达安基因公司，批号：20190226）；结晶紫（Baso 公司，批号：419012）；PTC-200 型PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 DNA 的提取

常规复苏菌株，接种于血平板，置37℃，5%CO2培养20 h，挑起单克隆于1 mL 的生理盐水中，10 000 r/min离心5 min，离心机半径9.5 cm，去上清，收集细菌。加入30 μL 的DNA 提取液，吹打混匀，100℃加热10 min，冷却后10 000 r/min 离心5 min，离心机半径9.5 cm，上清液即为含有DNA 溶液。

1.4 生物被膜表型分析

生物被膜形成能力的检测参照Vuong 等[4]的报道，接种于液体LB 培养基中，通过37℃，220 r/min 振摇培养20 h，用含0.25%葡萄糖的TSB 培养基于1∶200 稀释配置成试验菌液，每孔200 μL 接种于96孔培养板，每个菌株重复8 孔，以空白TSB 培养基为对照，置于37℃培养箱，静置培养48 h 后，弃菌液，每孔每次加入200 μL 超纯水，洗3 次，60℃干燥1 h，配制0.1%结晶紫溶液每孔加入200 μL 染色10 min，每孔每次加入200 μL 超纯水，洗3 次，去除未结合的染料，60℃干燥1 h，每孔加入5%乙酸溶液200 μL，溶解染料。在波长为570 nm 处，通过酶标仪测定吸光度，将每个菌株的平均吸光度值用于计算。生物被膜形成阳性株的筛选条件为：将标准菌株（ATCC12228）的平均值A+3 倍标准差定义为界定值，如菌株的平均值A＞界定值则认为生物被膜阳性。

1.5 分子生物学鉴定

根据Fredheim 等[5]的研究结果，SE 具有esp 特异基因，进一步通过分子生物学鉴定临床菌株的有效性。

1.6 agr 基因多态性分析

根据Lina 等[6]的研究报道，通过多重PCR 对菌株进行agr 基因多态性分型。agr 分型所涉及的引物序列、PCR 产物长度等相关信息见表1。PCR 反应体系包含上下游引物10 μmol/L 各0.1 μL，2×Taq PCR Master Mixture 10 μL，细菌模板DNA 2 μL，加ddH2O 补充至20 μL。PCR 反应条件为：95℃预变性5 min，30 个循环（94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min），最后72℃充分延伸10 min。

表1 研究中用到的引物序列及PCR 实验

2 结果

2.1 分子生物学鉴定SE

临床分离血液来源的SE 共81 株，无重复菌株，所有菌株通过PCR 扩增为esp 阳性。部分PCR 产物电泳结果见图1。

图1 8 株临床分离的血液来源的SE 的分子生物学鉴定结果

2.2 血液来源的SE 生物被膜形成能力

通过半定量黏附试验检测临床分离血液来源的SE 菌株的生物被膜形成能力。以标准菌株ATCC-12228 为阴性对照，标准菌株ATCC35984 为阳性对照，部分分析结果见图2。ATCC12228 标准菌株的A 值为（0.28±0.01），则定义界定值为0.33，菌株A 值＞界定值则为生物被膜形成阳性菌株。根据半定量黏附试验结果，81 株SE 中，共有54 株阳性，占66.67%。

图2 生物被膜形成能力检测

2.3 agr 基因多态性分析

通过多重PCR 分析5 个菌株agr 基因多态性，PCR 产物经的凝胶电泳结果见图3。临床分离血液来源的81 株SE 中，agr I 型51 株（62.96%），agr Ⅱ型6 株（7.41%），agr Ⅲ型7 株（8.64%），agr 未分型17 株（20.99%）。

图3 5 株SE 的agr 多态性分析结果

3 讨论

根据2017 年中国细菌耐药检测（CHINET）数据显示，80.3%的凝固酶阴性葡萄球菌为甲氧西林耐药株，且表现为对绝大多数测试药物耐药[7]。SE 是最主要的凝固酶阴性葡萄球菌，近年来随着中心静脉导管、人工关节、人工心脏起搏器和人工心脏瓣膜等介入性医疗设施的临床广泛使用，生物被膜相关性感染越来越受到人们重视[8]。SE 的最主要的致病机制是在植入的医疗设备上形成生物被膜，生物膜中的细菌对抗生素的抵抗力是浮游细胞的500～1000 倍[9]。这将导致感染呈复发性或难治性，治疗失败[10]。SE 的生物被膜形成及相关感染已引起临床高度重视，也给临床治疗带来巨大的挑战。

SE 的agr 在生物被膜形成过程中起中心调节作用，是SE 最为重要的毒力因调节系统[11]。agr 是SE 最重要的群体感应系统，能调节细胞间的通讯和细菌的定殖，介导SE 毒力因子的表达，与SE 的侵袭性和生物被膜中细菌的再传播性密切相关。Dai 等[3]研究结果提示，抑制agr 表达，可导致细胞自溶，生物被膜分散，使得生物被膜中的细菌扩散，最终促进新生物膜的形成。Patel 等[12]通过分析SE 的分子特征和生物被膜形成发现，agr 可能是SE 致病力的一个重要分子标记。Dufour 等[13]通过基因序列分析技术发现SE 一般可分三型（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型），但agr 不同基因型之间的相互作用，还有待进一步研究[14-15]。Li等[16]发现致病菌和非致病菌的agr 型别不同，临床致病的SE 以agr Ⅰ型为主，而皮肤表面分离的正常SE 以agr Ⅱ型为主，同时还发现具有大约15%的SE 有agr 自然突变。Hellmark 等[17]研究结果提示，导致人工关节感染的SE 主要是agr Ⅰ型和agr Ⅲ型。唐光敏等[18]研究发现临床分离的金黄色葡萄球菌以agr Ⅰ型为主。但是，对于导致血流感染的SE 研究较少。本研究以血液来源的SE 为研究对象，分析菌株agr 多态性，为下一步的研究奠定基础。研究发现81 株临床分离的SE 中，agrⅠ型51 株（62.96%），agr Ⅱ型6 株（7.41%），agr Ⅲ型7 株（8.64%），agr 未分型17 株（20.99%）。提示血液来源SE 以agr Ⅰ型为主，agr 未分型较普遍。结果中agr未分型菌株为17 株，这可能是agr 自然突变导致。多种细菌和宿主因素等可影响agr 系统的活性，这些因素对葡萄球菌造成了巨大的选择压力，细菌可通过agr位点突变来应对这种选择[19]。Vuong 等[4]研究发现，agr突变的SE 菌株，其生物膜的形成能力和初始黏附能力均增强。因此，进一步研究17 株agr 未分型菌株的分子生物学特征和生物被膜的形成能力是非常有意义的课题。

本研究通过分析临床分离血液来源SE 的agr 多态性，为了解临床分离血液来源SE 的分子特征与生物被膜形成奠定了基础。临床分离血液来源SE 具有较高的生物被膜形成能力，提示具备强致病率和院内感染率，应引起临床重视。进一步分析了临床分离血液来源的SE 的生物被膜形成能力，发现81 株SE 中，有54 株生物被膜形成阳性，占66.67%。提示临床血液来源的SE 中有很强的生物被膜形成能力，即致病能力。近年来，研究发现生物被膜的主要包含多糖细胞间黏附素、细胞锚定蛋白和胞外DNA 3 种组成，这3 种成分在生物被膜形成中具有重要作用[20-23]。在下一步的研究中，我们将进一步研究临床SE 的生物被膜形成机制。