对比剂肾病大鼠肾脏bax 及bcl-2 表达及羟苯磺酸钙干预研究

李 伟 于芬芬 季文萱 何晓艳 潘配强， 孙 艳 黄俊彦

1.青岛大学医学院，山东青岛 266021；2.山东省临沂市平邑县中医医院肾内科，山东平邑 273300；3.青岛市中心医院肾内科，山东青岛 266042；4.青岛市市立医院肾内科，山东青岛 266011

随着介入手术治疗推广和完善，术中造影剂导致肾功能损伤明显增加，由造影剂导致的肾病目前已成为肾功能不全的第三位原因，特别是对糖尿病肾病、肾功能损伤、充血性心力衰竭等高危患者，发生率可高达50%[1]。对比剂肾病（CIN）发病机制尚不明确，且缺乏有效治疗措施。研究表明，细胞凋亡与CIN 的发生、发展关系密切，但具体机制尚不清楚[2]。羟苯磺酸钙为微循环改善剂及抗氧化剂，具有抗细胞凋亡的作用[3]。本实验通过建立CIN 大鼠模型，旨在探讨CIN 大鼠肾脏bax 及bcl-2 的表达及羟苯磺酸钙干预效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

实验动物：84 只清洁级、雄性Wistar 大鼠，体重（220±20）g，鼠龄8～10 周，北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK-（京）2012-0001]，合格证号：11001 1171100273。在（23±2）℃环境中采用12 h 昼夜节律饲养，自由地饮水与进食，实验动物及条件符合《实验动物管理条件》要求，且经青岛大学实验动物伦理委员会批准。试剂：羟苯磺酸钙（海南林恒制药），bax、bcl-2 抗体（博士德），760 g/L 泛影葡胺（上海旭东海普药业），吲哚美辛（INDO）购自Sigma（美国），N-硝基-LL-精氨酸甲酯（L-NAME）购自Sigma（美国），TUNEL 试剂盒（Roche，生产批号：J180573）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 84 只大鼠按照随机数字表法分为假手术组（A 组）、模型组（B 组）和羟苯磺酸钙干预组（C 组），每组28 只。造模当天将B 组和C 组大鼠尾静脉植入1 枚留置针，间断15 min 顺次将INDO、L-NAME、760 g/L 泛影葡胺进行注射，剂量为10 mg/kg。CIN 造模成功标准：注射对比剂后48 h 的血清肌酐（Scr）升高≥25%或Scr 绝对值升高≥44.2 μmol/L[4]。A 组将760 g/L 泛影葡胺更换为生理盐水造模。C 组于造模前3 d 与当天给予羟苯磺酸钙进行灌胃，剂量100 mg/（kg·d），A 和B 组等体积生理盐水灌胃。

1.2.2 标本收集 分别于造模后12、24、48、72 h 批量处死，腹主动脉取血，常规取肾脏，1/4 的组织浸泡10%中性甲醛浸泡，剩余肾脏组织液氮速冻，-80℃储存。

1.2.3 血清生化指标检测 采用上述步骤各实验点留取血样，监测血清尿素氮（BUN）和Scr 水平。

1.2.4 病理检查 采用石蜡包埋，切片，制备成为病理观察切片，并采用HE 染色（上海研域化学试剂有限公司），光学显微镜观察。

1.2.5 肾细胞凋亡监测（TUNEL）选择造模后48 h 肾组织，采用甲醛固定后，制备成为组织切片，经水合、脱蜡等过程，TUNEL 反应液添加入切片组织，辣根过氧化酶（荧光素抗体标记）处理，二氨基联苯胺显色，光学显微镜下随机选取（400×）视野5 个，观察计数，计算细胞凋亡指数。

1.2.6 bax、bcl-2 蛋白组织表达水平测定 取上述病理切片，充分脱蜡，1%甲醇双氧水处理、抗原修复液修复、封闭、添加一抗（兔抗大鼠bax/bcl-2，南京建成生物科技公司）、二抗（河北博海生物工程开发有限公司）；链霉卵白素（辣根酶标记，杭州联科生物技术公司）工作液处理，DAB 显色（北京中杉金桥生物技术有限公司），苏木精复染，封片，光学显微镜下观察。

1.2.7 bax、bcl-2 蛋白相对表达量（Western blot）将各肾组织经过研磨、分离、沉淀等步骤获得含有bax、bcl-2 蛋白的上清液，95℃水浴变性；SDS-PAGE凝胶80V 进行电泳，蛋白转膜至PVDF 膜，顺次加入一抗（兔抗大鼠bax/bcl-2，南京建成生物科技公司）、二抗（南京建成生物科技公司）；ECL 法（深圳达科为生物技术股份公司）测定其免疫活性，曝光、洗膜、显影等过程后，UVP 分析仪测定灰度值，选择β-actin 基因作为内参。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，各组比较采用重复测量的方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点血清生化指标水平比较

B 组和C 组造模后12、24、48、72 h 血清BUN 和Scr 水平显著高于A 组同期，C 组造模后12、24、48、72 h 血清BUN 和Scr 水平显著低于B 组同期（P <0.05）；与造模后12 h 比较，B 组和C 组造模后24、48、72 h 血清BUN 和Scr 水平均显著升高（P <0.05）；与造模后24 h 比较，B 组造模后48 h 血清Scr 水平显著升高，C 组造模后48 h 血清BUN 和Scr 水平均显著升高，C 组造模后72 h 血清Scr 水平显著降低（P <0.05）；与造模后48 h 比较，B 组和C 组造模后72 h 血清BUN 和Scr 水平均显著降低（P <0.05）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点血清生化指标水平比较（）

表1 各组大鼠不同时间点血清生化指标水平比较（）

注：与同组造模后12 h 比较，*P<0.05；与同组造模后24 h 比较，△P <0.05；与同组造模后48 h 比较，#P <0.05；与A 组同期比较，■P <0.05；与B 组同期比较，★P <0.05。Scr：肌酐；BUN：尿素氮

2.2 各组大鼠不同时间点病理变化

A 组病理改变不显著；B 组造模后12 h 出现广泛肾小管上皮细胞空泡样变性、部分肾小管坏死，肾间质纤维化；C 组肾小管间质病变显著改善。见图1。

2.3 各组大鼠造模后48 h 肾细胞凋亡情况

A 组大鼠肾细胞无明显凋亡；B 组大鼠肾细胞凋亡指数显著高于A 组，C 组肾细胞凋亡指数显著低于B 组，但高于A 组（P <0.05）。见图2。

图1 各组大鼠不同时间点病理变化（HE 染色，400×）

图2 各组大鼠造模后48 h 肾细胞凋亡情况（TUNEL，400×）

2.4 各组大鼠不同时间点肾组织bax、bcl-2 免疫组化积分吸光度表达水平比较

B 组大鼠bax 表达水平显著高于A 组，C 组bax表达水平显著低于B 组，但高于A 组（P <0.05）；B 组大鼠bcl-2 表达水平显著低于A 组，C 组bcl-2 表达水平显著高于B 组，但低于A 组（P <0.05）。见图3。

2.5 各组大鼠不同时间点肾组织bax、bcl-2 蛋白相对表达量比较

B 组大鼠bax 蛋白相对表达量显著高于A 组，C 组bax 蛋白相对表达量显著低于B 组，但高于A 组（P <0.05）；B 组大鼠bcl-2 蛋白相对表达量显著低于A 组，C 组bcl-2 蛋白相对表达量显著高于B 组，但低于A 组（P<0.05）。见图4～5。

图3 各组大鼠不同时间点肾组织bax、bcl-2 免疫组化积分吸光度表达水平比较（n=7）

图4 各组大鼠不同时间点肾组织bax、bcl-2 蛋白相对表达量

图5 各组大鼠不同时间点肾组织bax、bcl-2 蛋白相对表达量比较（n=7）

3 讨论

CIN 为目前肾功能损伤常见疾病，但目前发病原理尚不明确，与肾组织血流分布、自由基损伤、炎症侵袭等有关，CIN 细胞凋亡是主要发病原因[5-8]。为增加造影剂对肾脏血流的持续性减少，注射INDO 和LNAME 可有效阻断前列腺素和一氧化氮合成酶，制备持久性的肾功能衰竭大鼠模型[7]。在本实验中，B 组相对于A 组，其肾小管上皮细胞的凋亡程度加剧，凋亡指数上升明显，提示细胞凋亡可能参与CIN 的发生、发展，与相关研究结果一致[6，9-14]。

bcl-2 是细胞凋亡过程中重要的调节元件，与bax蛋白的表达量相对稳定，促凋亡因子的bax 在细胞内表达增加时，造成细胞死亡信息被放大，细胞凋亡启动；而作为抗凋亡因子的bcl-2 表达增加时对抗其诱导凋亡的作用，延长细胞存活期[15-18]。本实验通过检测CIN 大鼠肾组织bax 和bcl-2 的表达情况，进一步证实细胞凋亡与CIN 的发生关系密切，提示对比剂可能通过增加bax 表达、降低bcl-2 表达诱导CIN 大鼠肾细胞凋亡[6，19]。

羟苯磺酸钙作为一种血管保护性药物，通过调节细胞凋亡使原发性静脉曲张，保护肾脏[20-21]。通过HE染色及TUNEL 染色观察到肾损伤主要为肾小管间质病变，与B 组比较，C 组大鼠肾病理改变及肾小管上皮细胞凋亡明显减轻，说明羟苯磺酸钙对CIN 大鼠具有保护作用。bax 表达明显升高，而bcl-2 表达明显下降，说明bax、bcl-2 调控的细胞凋亡可能参与CIN 的发生、发展。以上实验结果提示，羟苯磺酸钙可能通过减少bax 的表达及增加bcl-2 表达减轻CIN 模型大鼠肾细胞凋亡，从而发挥对CIN 大鼠的保护作用。

综上所述，bax、bcl-2 调控的细胞凋亡参与CIN的发生、发展，羟苯磺酸钙阻断bax 表达，上调bcl-2表达，发挥保护作用。