脓肿分枝杆菌临床分离株抗生素敏感性与基因型的关系

毛彦华 禇海青

上海市肺科医院呼吸内科，上海 200433

脓肿分枝杆菌是快速生长的非结核分枝杆菌，致病时可引发皮肤和软组织感染，也可侵犯肺部，引起结核性肺病，易伴发医源性感染甚至暴发流行[1]。近年来，随着内窥镜、手术、移植、侵入性操作等增加及免疫功能障碍患者数量增多，脓肿分枝杆菌感染的发病率迅速上升[2]。国外研究报道显示，脓肿分枝杆菌以韩国较为常见[3]。国内相关研究显示，我国南方地区脓肿分枝杆菌的检出率较高[4]。陈华等[5]研究显示，脓肿分枝杆菌检出率为48.59%；潘建华等[6]研究显示，脓肿分枝杆菌的检出率为21.68%，且非结核分枝杆菌均具有较高的耐药性。二者研究检出率差异较大，主要考虑潘建华等[6]样本量较大且时间跨度较长。脓肿分枝杆菌对多数一线抗生素耐药，对抗结核药物自然耐药，长期联合应用抗生素治疗也常效果欠佳[7]，多根据药敏试验结果进行抗生素的选择。2007年美国胸科协会指南建议将克拉霉素（CLA）纳入脓肿分枝杆菌的治疗，但CLA 效力与细菌的基因型密切相关，其他感染性脓肿分枝杆菌的基因鉴别对抗菌药物的选择有重要意义[8]。本研究探讨了上海市肺科医院（以下简称“我院”）常用抗生素敏感性与脓肿枝杆菌基因型之间的关系。现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年1月～2018年9月我院分离出的脓肿分枝杆菌分离株87株进行研究。纳入标准：临床诊断明确，病历资料完整。排除标准：①准备或已纳入其他临床研究；②入组前3个月内应用抗生素；③合并严重恶性疾病、精神状态异常。其中痰标本72株，支气管肺泡灌洗液15株，所有菌株均经MGIT960培养基生长和对硝基苯甲酸试验鉴定为非结核分枝杆菌，通过对rPOB 基因测序进一步鉴定为脓肿分枝杆菌。本研究经我院医学伦理委员会批准通过，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

BACTECMGIT 960分枝杆菌培养仪（美国BD 公司），7500型PCR 扩增仪（美国ABI 公司），Extractor36型核酸提取仪（中国博奥生物有限公司）、基因微阵列芯片杂交盒和PCR 扩增反应试剂盒（中国博奥生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 取10 μL 细菌转移到含有TE 缓冲液和玻璃珠的微离心管中，涡旋后，1份样品与溶菌酶在37℃下孵育过夜。后加入十二烷基硫酸钠和蛋白酶K，在65℃下继续孵育20 min。再加入10%N-乙酰基N,N,N-三甲基溴化铵和0.7 mol/L 氯化钠以及0.5 mol/L 氯化钠。将混合物在65℃下孵育20 min 后，加入氯仿-异戊醇（24∶1），常温下12 000 r/min 离心10 min，离心半径8 cm。剩余的水相中DNA 用异丙醇沉淀，13 000 r/min 离心10 min 收集。用乙醇沉淀洗涤，溶解于Te 缓冲液中，使用NanoDrop2000超微量分光光度计对基因组DNA 进行定量，用高质量DNA样品构建350～450 bp 的片段文库。使用来自每个菌株的纯化基因组DNA 构建测序文库，按照Illumina标准基因组DNA 文库制备方案制备插入程度约为400 bp 的配对端文库，使用Covaris 聚集超声仪将纯化的基因组DNA 剪切成较小的片段，用T4DNA 聚合酶产生钝端，在3′末端添加A 碱基后，将适配器连接到钝化的磷酸化DNA 片段的每个末端，片段经凝胶电源纯化，PCR 扩增，在PCR 过程中，将索引标签引入到适配器中，并进行库质量测试。将符合条件的ILITA配对末端文库用于Illumina HISEQ 测序（150 bp×2）。SPAdes 与Bayeshammer 组合纠正序列组错误，然后用SPAdes 的默认参数组装基因组，使用QuAST 评估组装结果。采用NCBI Nucleotide blast program 进行SNP 分析，选择M.脓肿标准菌株ATCC19977作为rrl 和ERM（41）T28的参考菌株，选择CR5701（HQ127366.1）作为ERM（41）C28的参考菌株，选择CCUG48898（AP014547.1）作为M 型的参考菌株。

1.3.2 药敏试验 采用微量稀释法[9]测定抗生素敏感性，测试我院常用治疗脓肿分枝杆菌抗生素的敏感性，包括磺胺类（SXT）、莫西沙星（MXF）、头孢西丁（FOX）、阿米卡星（AMI）、强力霉素（DOX）、替加环素（TGC）、克拉霉素（CLA）、利奈唑胺（LZD）、亚胺培南（IMI）和妥布霉素（TOB）。在脓肿分枝杆菌复合群鉴定后3 d（ERT）、14 d（LRT）评估敏感性，敏感菌株最低抑菌浓度（MIC）≤2 mg/L，中间MIC=4 mg/L，获得性耐药菌株MIC≥8 mg/L，诱导性耐药菌株在ERT时MIC≤4 mg/L，LRT 时MIC≥8 mg/L，以金黄色葡萄球菌为对照品系[10-13]。

2 结果

2.1 脓肿分枝杆菌分离株药敏性

87株分离种包括81个subsp.abscessus 和6个subsp.massiliense，81个subsp.abscessus 共72个ERM（41）T28序列和9个ERM（41）C28序列，ERM（41）序列对10种抗生素的敏感性。见表1。

2.2 脓肿分枝菌对CLA 敏感性

81个subsp.abscessu 亚型中包括41个CLA 敏感株和10个CLA 中介株，8个ERM（41）C28和43个ERM（41）T28分离株不存在rrl 2058/2059突变，30个耐药分离株中包括29个ERM（41）T28分离株（其中5个发生rrl 2058/2059突变）和1个ERM（41）C28分离株（1个发生rrl 2058/2059突变）。Subsp.massiliense耐药分离株2个，1个发生rrl 2058/2059突变。见表2。

表1 脓肿分枝杆菌分离株的抗生素敏感性

3 讨论

研究显示，脓肿分枝杆菌23S rRNA（RRL）基因2058/2059（大肠埃希菌编号）位点的点突变可导致获得性CLA 抗性，完整的ERM（41）基因第28核苷酸处显示为T/C 多态性。当胸腺嘧啶为核苷酸时，CLA 诱导的ERM（41）T28基因产物甲基化核糖体23S mRNA可防止CLA 与核糖体结合，表现为CLA 抗性。当ERM（41）基因第28核苷酸是胞苷时，则CLA 抗性丧失[14-16]。因此，脓肿分枝杆菌抗生素敏感性研究多集中于ERM（41）和2058/2059 rrl 基因突变。

表2 脓肿分枝菌对CLA 敏感性（例）

国外研究[17-18]显示，脓肿分枝杆菌CLA 耐药性比例为2.51%（美国）～15.84%（韩国）。本研究结果显示，ERT 评估脓肿分枝杆菌耐药性的比例为36.78%，高于国外研究结果，考虑与各国人口基线的不均衡性、抗生素管理和临床应用差异等因素有关。进一步分析显示，subsp.abscessu 亚型中仅有6例有2058/2059 rrl 突变，其他24个分离株中未检测到2058/2059 rrl 突变。未检测到2058/2059 rrl 突变的24个分离株属于ERM（41）T28，进一步分析可知，24株分离株患者分离前有22株曾用过大环内酯类药物，既往有大环内酯类药物应用史可能是导致CLA 耐药性的重要原因。在subsp.massiliense 亚型中分离出的2株CLA 抗性株中，仅1例具有2058/2059 rrl 突变，因为subsp.massiliense 具备不完全/分功能性ERM（41），无2058/2059 rrl 突变株CLA 耐药机制有待进一步研究探讨。有研究[19]显示，长期接触CLA 可导致50S核糖体亚基结构改变，暴露后多数患者出现2058/2059 rrl 突变，但有2.5%的rpⅣ基因有18 bp 插入突变，编码L22核糖体蛋白。本研究未发生2058/2059 rrl突变的CLA 抗性菌株中未发现rpⅣ突变。

AMI 也是治疗脓肿分枝杆菌的常用药物。研究[20]显示，AMI 耐药的潜在机制是rrs 基因核苷酸1408的A-G 突变。本研究仅有1株检测出AMI 抗性，且未检测到rrs 1408突变。本研究认为AMI 治疗本地区脓肿分枝杆菌似乎优于CLA，其有效性值得进一步研究探讨。本研究中，其他抗生素均未检测到耐药相关基因型。综上所述，rrl 和ERM（41）基因型对脓肿分离杆菌临床分离株CLA 耐药具有一定预测作用，AMI 治疗脓肿分枝杆菌可能具有更佳效果，值得进一步研究探讨。

本研究不足之处及下一步研究方向：本研究纳入样本量相对较少，且缺乏脓肿分枝杆菌临床分离株抗生素敏感性与基因型关系的探讨。在日后的研究中应进一步扩大样本量，采用大样本、多中心分析二者关系以进一步论证本文研究结果。