急性痛风性关节炎大鼠中IL-17和NF-κB 的表达和意义

沈瑞明 钟良宝 郑颜萍 梁海琴

海南医学院第一附属医院肾病风湿科，海南海口 570102

急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）是尿酸盐沉积关节而引起的一种强烈的急性炎性反应，然而其确切机制尚未完全明了。其中，炎性反应中有诸多机制参与该过程，研究表明，白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等炎症因子参与了痛风的进程，且它们之间相互作用、相互促进[1-2]。白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）主要由辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）产生，参与先天和适应性免疫应答，与多种自身免疫病的发病有关[3-4]。迄今为止，对IL-17在AGA 中的作用知之甚少。近期的研究表明，先天免疫参与了痛风的发病，痛风患者血清IL-17表达水平明显升高[5-6]。研究表明，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是炎症、免疫等细胞反应的初级转录因子，调节众多的细胞因子的表达。NF-κB 是许多炎症相关基因转录调控的枢纽[7]。IL-17与NF-κB 在AGA 中的表达尚鲜见报道。本研究通过建立AGA 模型，研究IL-17、NF-κB等在AGA 患者血清中的表达，从而探讨两者在AGA 中作用机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠，质量（200±20）g，由海南医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：HNXK（琼）2017-0018。

1.2 主要仪器与试剂

尿酸钠购自美国Sigma 公司，其他试剂均为分析纯。p-NF-κB p65抗体购于美国Abcam 公司，大鼠IL-1β、IL-17及TNF-α 试剂盒均为美国R&D 公司进口分装酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒。

1.3 实验分组与处理

1.3.1 动物分组 45只SD 大鼠按随机数字表法分为对照组（9只）和模型组（36只），模型组分为4个亚组：6、12、24 h 及72 h，每组9只。

1.3.2 造模 适应性喂养1周，AGA 大鼠模型造模方法参照Coderre[8]方法制作，对照组注射等体积生理盐水。造模后各组大鼠右后踝关节均出现肿胀，造模成功。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 一般情况观察 观察大鼠造模前后活动、进食、精神情况、体重、步态等情况。

1.4.2 各组大鼠血清炎症因子测定 造模后于相应时间点，用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹静脉取血4～6 mL，室温静置25 min 后置3500 r/min离心机离心10 min，用吸液管取上清液，ELISA 法测定IL-1β、IL-17及TNF-α 水平。

1.4.3 各组大鼠滑膜组织炎症因子测定 造模后于相应时间点，过量麻醉处死各组大鼠，置于有冰块的干燥托盘内快速分离出右踝关节及周围软组织，切取滑膜组织，制成匀浆，4℃下8000 r/min 离心5 min 后取上清液，ELISΑ 法测定IL-1β、IL-17及TNF-α 水平。

1.4.4 蛋白印迹法（Western blot）检测关节滑膜组织NF-κB 的表达 过量麻醉处死大鼠，取受试关节上下5 mm 的滑膜组织，置于冰上匀浆，按照说操作明书提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，Western blot 检测滑膜组织中p-NF-κB 的表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

45只大鼠均进入结果分析，造模后大鼠烦躁，右后踝关节明显红肿、活动受限，对照组无烦躁等表现，右后踝关节较造模前相比略有增粗，72 h 后模型组大鼠烦躁、关节红肿、活动受限明显减轻。

2.2 AGA 大鼠血清及滑膜中的炎症因子变化

模型组血清和滑膜中IL-1β、IL-17及TNF-α 的水平均明显高于正常对照组，差异有高度统计学意义（P <0.01）。模型组中，6 h 后随时间的变化，大鼠血清和滑膜中IL-1β、IL-17及TNF-α 的水平逐渐下降（P <0.01）。见表1～2。

表1 各组大鼠血清中各炎症因子水平的比较（ng/L，，n=9）

表1 各组大鼠血清中各炎症因子水平的比较（ng/L，，n=9）

注：与对照组比较，*P <0.01。IL-1β：白细胞介素1β；IL-17：白细胞介素17；TNF-α：肿瘤坏死因子-α

表2 各组大鼠滑膜中各炎症因子水平的比较（ng/L，，n=9）

表2 各组大鼠滑膜中各炎症因子水平的比较（ng/L，，n=9）

注：与对照组比较，*P <0.01。IL-1β：白细胞介素1β；IL-17：白细胞介素17；TNF-α：肿瘤坏死因子-α

2.3 关节滑膜组织中p-NF-κB p65的表达

造模后6 h，p-NF-κB p65的表达量较对照组明显升高（P <0.01），12 h 其表达量达到顶峰，但在造模后24 h 开始下降，72 h 表达量显著下降，但仍高于正常；造模后12 h，p-NF-κB p65的表达量显著高于6 h（P <0.01），24 h 后其表达量明显低于12 h（P <0.01），72 h 后其表达量显著低于24 h（P <0.01）。见图1。

图1 急性痛风性关节炎大鼠关节滑膜组织中p-NF-κB p65的表达

3 讨论

痛风是由关节和软组织中的尿酸单钠（MSU）晶体沉积诱发的具有自限性和剧烈疼痛等特点的炎症性疾病，可导致急性或慢性关节炎。目前，普遍认为痛风性关节炎主要是由中性粒细胞介导的炎性反应，尿酸盐晶体能够引发白细胞和滑膜细胞的炎性反应，触发细胞因子和其他炎症介质的释放，从而吸引更多的中性粒细胞聚集，吞噬结晶的中性粒细胞释放溶酶体酶，导致组织损伤，从而放大局部炎性反应[9]。MSU 晶体是炎症的有效诱导剂，可以引发、放大和维持强烈的炎性反应[6,10]。然而，这些晶体引发急性炎症的机制尚不清楚。

IL-17是具有广泛生物学活性的细胞因子，参与了体内大量的炎性反应，在炎症性疾病的发生及发展过程中发挥重要作用[11-12]。NF-κB 是重要的转录调节因子，调控体内诱导趋化因子、细胞因子、补体等细胞因子的转录[13]。近年来，NF-κB 信号通路被认为与AGA 的发病及炎性反应密切相关[14]。NF-κB 参与了调控AGA 重要细胞因子的表达，这些细胞因子对免疫细胞的活化、增殖、浸润、趋化和分泌起着直接的调控作用[15]。在AGA 时，活化的核转录因子NF-κB 进入细胞核，启动靶基因并促使靶基因转录，进而调控下游基因的表达，从而诱导IL-1β、IL-18、TNF-α等细胞因子的分泌，IL-1β、IL-18、IL-23等相互作用，促进Th17细胞分化，从而产生增强局部炎症的IL-17[16]。相关性分析表明IL-17表达不仅与AGA 活动呈正相关，而且与IL-1β 的血清水平相关[12]。既往研究认为，IL-1β 被认为是AGA 调节的关键因素[17-18]。近期的研究表明，IL-1β 在IL-17-γδT 细胞向IL-17+γδT 细胞的分化中起了重要的作用，IL-17可能是IL-1β 的下游促炎细胞因子[3,19]，它可作为AGA 的生物标志物之一。

本研究结果表明，大鼠在AGA 造模后，精神、进食、活动明显减少，右后踝关节肿胀、活动受限，随时间的变化，其精神、活动逐渐改善，踝关节肿胀逐渐减轻。与对照组比较，造模后6 h，大鼠血清及滑膜中IL-1β、IL-17及TNF-α 表达明显增高，12 h 达顶峰，24 h 逐渐降低。表明大鼠关节腔注射尿酸钠后，迅速诱发关节及周围组织的炎性反应，激活IL-1β 促使趋化因子、炎性因子等细胞因子发挥促炎作用，导致单核巨噬细胞分化、中性粒细胞释放、炎症复合体活化等，T 细胞分化产生IL-17，诱发痛风急性炎症[20]；此外，IL-1β 可激活破骨细胞使其分化，并作用于神经元，触发机体对炎症所致疼痛反应的过度敏感[21]。而TNF-α 又能通过相关信号通路促使IL-1β、IL-17等细胞因子分泌，中性粒细胞、单核巨噬细胞出现吞噬活性并释放氧自由基及蛋白水解酶，导致尿酸盐沉积处出现充血、水肿，促使大量炎症细胞浸润，并不断加重。同时，磷酸化NF-κB p65的表达水平在造模后6 h明显增高，12 h 表达最高，24 h 逐渐下降，提示AGA 后，NF-κB 被激活，活化的NF-κB 进入细胞核，完成相关炎性基因的转录，启动IL-17、IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达，促进炎症级联反应，导致AGA 炎性反应发生，随实验的进展，关节炎逐渐改善，炎症逐渐减轻，p-NF-κB p65的表达水平逐渐下降，进一步证实了NF-κB 信号通路与AGA 的发病密切相关。

综上所述，AGA 后，IL-17与NF-κB 的表达先迅速增高，随时间的变化，逐渐下降，两者之间变化与AGA 过程密切相关。预示IL-17可能作为AGA 的一种新的生物标志物，可用于AGA 的诊断与治疗评估。尽管AGA 免疫机制尚未完全明了，然而痛风急性炎症过程中IL-17与NF-κB 之间的相互关系，为该病的治疗提供了新思路和切入点。