OPG-HSP70对CIA 小鼠模型血清学参数的影响及其与疗效的相关性分析

夏思思 赵文明 荣雨佳

1.首都医科大学附属北京朝阳医院风湿免疫科，北京 100020；2.首都医科大学基础医学院免疫学系，北京 100069；3.中国航天科工集团七三一医院检验科血库，北京 100074

骨保护素（osteoprotegerin，OPG）可明显改善类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的骨流失，但对抑制滑膜炎没有作用[1-2]。热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）中某些保守的、具有与哺乳动物HSP同源序列的交叉反应性T 细胞表位可抑制关节炎进展[3-4]。为了改善RA 骨破坏及炎症损伤，本实验室将结核杆菌HSP70的部分基因序列引入到人OPG 功能性基因片段中，制备了OPG-HSP70融合蛋白，并利用胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型鼠评估其改善滑膜炎和骨侵蚀的作用。CIA 是经典的RA 动物模型，常用来研究RA 病理改变和评估新药[5-6]。鉴于中和抗体产生是生物制剂长期应用后疗效降低的机制之一[7-8]，本研究分析了应用OPGHSP70融合蛋白后血清核因子κB 受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、Ca2+、Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ，CⅡ）抗体与CIA小鼠滑膜炎及骨量改变的相关性，并检测了融合蛋白的免疫原性，为研发同时拮抗RA 炎症和骨破坏药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

OPG、OPG-HSP70融合蛋白为首都医科大学基础医学院免疫学实验室保存。牛CⅡ蛋白、含4 mg/mL卡介苗的完全弗氏佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）和牛CⅡ抗体测定试剂盒均购自美国Chondrex公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 抗体购自美国SAB 公司；小鼠RANKL 酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒和人OPG 重组蛋白均购自美国R&D 公司；钙离子检测试剂盒（DICA-500）购自美国BioAssay公司。

1.2 实验动物及分组

4～6周龄的SPF 级雄性DBA/1小鼠和雌雄各半的BALB/c 小鼠，体重（17±2）g，均购自北京华阜康科技有限公司，合格证号：0219345。小鼠在首都医科大学实验动物中心饲养，饲养及实验操作严格按照《首都医科大学实验动物伦理规范》进行，伦理审批号：SYXK2007-005。DBA/1小鼠按体重分为3组：OPGHSP70治疗组（n=20）、OPG 治疗组（n=12）和模型对照组（n=12）。BALB/c 小鼠按体重分为3组，OPGHSP70治疗组、OPG 治疗组和PBS 对照组，每组6只。

1.3 CIA 模型制备和评估

用CFA 与牛CⅡ（1∶1混合）在距DBA/1小鼠尾根部1.5 cm 处，皮内注射（100 μL/只）诱导CIA 模型。诱导后18 d 小鼠开始发病，最初表现为单关节肿胀，继而由趾端向踝关节发展。隔天按0～4分五级进行关节炎指数评分：无红肿记0分；累及一个关节红和/或肿胀记1分；累及两个关节的肿胀记2分；累及两个以上关节的肿胀记3分；包括踝关节在内的全部足爪肿胀记4分，每个足爪最高记4分，一只小鼠最高记16分，关节炎指数越高，炎症程度越重[9-10]。

1.4 给药方法

DBA/1小鼠发病后即参照文献进行相应给药处理[11-12]，连续4周隔日一次腹腔注射给药，剂量如下：OPG-HSP70治疗组[50 mg/（kg·次）]、OPG 治疗组[45 mg/（kg·次）]、模型对照组（等剂量PBS）。BALB/c小鼠免疫原性测定的给药剂量、方式、次数同DBA/1小鼠。

1.5 骨相对灰度值计算

DBA/1小鼠给药4周后断颈处死，将后肢去皮毛和多余皮下组织，按相同姿势固定于小动物专用的Micro-CT 测定板（由北京大学医学部实验动物中心提供）上，将四肢踝关节到趾间的部分扫描后进行三维重建，并进行灰度值计算[13]。

1.6 血清学指标检测

DBA/1小鼠处死当日眼眶静脉采血，分离血清，ELISA 法检测血清中抗CⅡ抗体和RANKL 的水平，化学法检测血清钙离子水平；BALB/c 小鼠给药后0、1、2、3周间断采集血清，ELISA 法检测OPG 抗体的水平。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD 检验；参数之间的相关性采用Logistic 线性回归分析。以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OPG-HSP70融合蛋白CIA 小鼠炎症和骨破坏的改善作用

胶原诱导后18 d，各组小鼠开始发病，与模型对照组比较，OPG-HSP70治疗组的关节炎指数明显降低（P ＜0.01），骨密度值明显增加（P ＜0.05），CⅡ抗体明显下降（P ＜0.01）；RANKL 水平下降，Ca2+水平增高，但差异均无统计学意义（P >0.05）。与OPG 治疗组比较，OPG-HSP70治疗组关节炎指数降低（P ＜0.05），骨密度增加（P ＜0.05）；与模型对照组比较，OPG 治疗组CⅡ抗体显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表1。

2.2 血清学指标与病情相关性分析

血清学指标与病情相关性分析的结果显示，血清中CⅡ抗体越高，关节炎指数越高，滑膜炎越重，呈正相关（r=0.892，P ＜0.01）。血清中Ca2+和RANKL 水平越高，骨密度值越低，骨破坏程度越重，呈负相关（r=-0.582、r=-0.588，均P ＜0.01）。见图1。提示应用OPG-HSP70治疗后，可以用血清学指标监测治疗敏感度。

表1 CIA 小鼠关节炎指数和血清学指标（）

表1 CIA 小鼠关节炎指数和血清学指标（）

注：与模型对照组比较，*P <0.05，**P <0.01；与OPG 治疗组比较，#P <0.05。CⅡ：Ⅱ型胶原；RANKL：核因子κB 受体活化因子配基；Ca2+：钙离子

2.3 血清免疫原性分析

为了明确OPG-HSP70融合蛋白的免疫原性，采用间接ELISA 法动态监测血清抗OPG 抗体的滴度。给药后，OPG-HSP70治疗组和抗OPG 治疗组均可检测到相应的抗体。给药后，OPG-HSP70给药组抗OPG 抗体水平均高于PBS 对照组（P <0.01）。但与OPG 治疗组比较，OPG-HSP70治疗组的OPG 抗体滴度在给药后2周开始低于OPG 治疗组，且随时间延长而逐渐下降，差异有统计学意义（P <0.05）。见表2。

图1 血清学指标与病情相关性分析

表2 血清抗OPG 抗体水平（OD450nm，）

表2 血清抗OPG 抗体水平（OD450nm，）

注：与PBS 对照组比较，*P <0.05，**P <0.01；与OPG 治疗组比较，##P <0.01。OPG：骨保护素；OPG-HSP70：骨保护素-热休克蛋白70；PBS：磷酸盐缓冲液

3 讨论

OPG 是1997年发现的肿瘤坏死因子受体家族新成员，为一种含有401个氨基酸的可溶性分泌型糖蛋白[14]。OPG 作为RANKL 的可溶性诱饵受体与破骨细胞上的核转录因子-κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）竞争结合RANKL，抑制破骨细胞分化、成熟而终止骨吸收，并通过接触到临近的成骨细胞促进骨形成。多项研究发现在RA 的关节滑膜及局部骨侵蚀处可见RANKL 表达异常增高[15]，而OPG 在RA 关节中的表达相对不足[16]。因此促进OPG 表达成为防治RA 关节骨侵蚀的有效途径。研究表明，OPG 在体内外能有效地阻止RA 患者破骨细胞的成熟与分化，抑制骨破坏，但对滑膜炎症没有作用[1]。为了使OPG 具有抑制炎症作用，本研究引入了HSP70片段制备了OPG-HSP70融合蛋白，关节炎指数和CⅡ抗体的明显下降提示引入HSP70后融合蛋白具备了抑制炎症的作用；且骨密度值出现上升，表明抑制炎症可进一步降低骨破坏。

HSP70的生物学作用主要是防止细胞凋亡、抗氧化、作为分子伴侣辅助蛋白折叠与转运[17-18]。近年研究表明HSP70具有抗炎作用，主要与其抑制NF-κB 的活性、减少炎症介质产生、增强抗炎细胞因子的表达有关[19-20]。本研究中，HSP70引入后构建的OPGHSP70融合蛋白不仅增加了抑制滑膜炎的效果，而且还具有调节免疫反应的作用，血清中反映疾病预后指标的CⅡ抗体水平下降，而且影响疗效的OPG 抗体也明显低于OPG 治疗组，这提示引入HSP70后可以使融合蛋白的免疫原性降低，有助于增加疗效。这可能是由于OPG 功能蛋白与HSP70重组后，蛋白空间结构的改变降低了其免疫原性，具体原因有待进一步研究。

综上所述，滑膜炎和骨损伤是类风湿关节炎两个最显著的病理学特征。本研究将OPG 和HSP70两者的功能性片段连接，制备了OPG-HSP70融合蛋白，去除了与RA 治疗无关，甚至对机体有害的肽段，也解决了由于HSP70发挥抑炎作用的功能片段小，可能不利于单独应用的问题；该融合蛋白能同时发挥两种功效，可一并治疗RA 的炎性反应和骨损伤这两个密切相关的病症。