齐墩果酸对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响及机制

李开瑞 刘 洁 李小娜 何迎春 徐朝军 宋 岚

1.湖南中医药大学研究生院，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学医学院，湖南长沙 410208；3.中医药防治眼耳鼻喉疾病湖南省重点实验室，湖南长沙 410208；4.湖南省中医药防治眼耳鼻咽喉疾病与视功能保护工程技术研究中心，湖南长沙 410208；5.湖南中医药大学第一附属医院胸心外科，湖南长沙 410000；6.湖南中医药大学中医学国内一流建设学科，湖南长沙 410000

肺癌是目前发病率和死亡率均居于首位的恶性肿瘤[1]，肺腺癌是肺癌最常见的组织学类型，约占所有肺癌的50%。目前肺腺癌治疗主要以手术和放化疗为主，但术后的复发转移、放化疗等不良反应，严重影响患者的生活质量和生存率。目前靶向治疗[2]对非小细胞肺癌疗效较好，但前期基因检测、后期靶向药物费用高以及耐药问题都不容忽视[3]。因此，寻找更为安全有效适合的治疗方法是目前肺腺癌研究热点之一。中药在治疗癌症中效果明显，安全性高，能提高患者生活质量和生存率。齐墩果酸[4]是一种五环三萜类化合物，广泛存在于山楂、女贞子、夏枯草等中药材中，作为广谱抗菌药临床上用于护肝降酶、治疗急性肝炎[4]等，研究发现其还具有降脂、降糖、抗癌[5-6]等作用，本文主要研究齐墩果酸对A549细胞增殖及凋亡的影响，探究其相关作用机制。以期为其临床应用于治疗肺腺癌提供实验依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肺腺癌A549细胞购自苏州北纳创联生物技术有限公司，由本实验室传代培养。

1.2 实验药物

齐墩果酸（上海金穗生物有限公司，货号：201804 03）；顺铂（Cis，Sigma 公司，货号：P4394-25MG）。

1.3 主要试剂

DMEM-高糖培养基（Hyclone，货号：SH30022 02B）；胎牛血清（Gibco，货号：A3160802）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（Solarbio，货号：M8650），Annexin VFITC/PI apoptosis Kit（联科生物，货号：70-AP101-100）。

1.4 主要仪器

全自动酶标分析仪（ELX800，BioTek 公司）、Cellometer Image Cytometer（K2，Nexcelom 公司）、CytationTM5细胞成像多功能检测系统（cytation5，BioTek 公司）、Odyssey-CLX 双色红外荧光成像系统（9140S/N CLX-1801，Gene 有限公司）。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞培养 将A549置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的DMEM-高糖培养基，在37℃、5%CO2、湿度饱和培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.5.2 MTT 法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，调整单细胞悬液浓度，铺于96孔板，每孔100 μL、4000个细胞，随机分为对照组、不同浓度齐墩果酸（0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L）组、阳性对照组（Cis，0.004 g/L）。待细胞贴壁后，弃尽原培养基，按实验分组每孔加入200 μL 药物，每个浓度设置5个复孔，分别培养24、48、72 h 后，弃尽原培养基后每孔加入100 μL 0.5 g/L MTT 溶液，于培养箱中继续培养4 h，弃尽MTT 溶液，每孔加入100 μL 二甲基亚砜（DMSO）于脱色摇床上室温避光震荡10 min，用酶标仪检测490 nm 处各孔吸光度值（A），计算细胞相对增殖率，细胞增殖率=（实验组A 值－空白组A 值）/（对照组A 值－空白组A 值）×100%。实验重复3次。

1.5.3 实时无标记细胞分析技术（RTCA）监测细胞增殖 取对数生长期的细胞，调整单细胞悬液浓度，铺于RTCA 电子检测板（E-Plate），每孔100 μL、4000个细胞，实验分组同“1.5.2”。待细胞指数（CI）达到1.0时，按实验分组每孔加入200 μL 药物，每组3个复孔，监测72 h 以上，实验重复3次。

1.5.4 Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞，调整单细胞悬液浓度，均匀铺于6孔板，1×105个细胞/孔，随机分为对照组、不同浓度齐墩果酸（1.25、5 μmol/L）组、阳性对照组（Cis，0.004 g/L），处理48 h 后，弃尽原培养液，PBS 清洗2次，每孔加入Hoechst 33342染色液（0.01 g/L）1 mL，避光染色30 min，弃尽染色液，PBS 清洗3次，CytationTM5拍照。实验重复3次。

1.5.5 线粒体膜电位检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞，调整单细胞悬液浓度，均匀铺于6孔板，1×105个细胞/孔。实验分组同“1.5.4”，处理48 h 后，弃尽原培养液，PBS 清洗2次，每孔加入1 mL JC-1染色工作液，避光染色30 min，弃染色液后PBS 洗涤2次，于CytationTM拍照。实验重复3次。

1.5.6 Annexin V-FITC/PI 双荧光染色法检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞，调整单细胞悬液浓度，均匀铺于100 mm 培养皿，6×105个细胞/皿，实验分组同“1.5.4”，处理48 h，收集细胞离心（1000 r/min，3 min），PBS 清洗2次，每管加入1×Binding Buffer 100 μL 重悬，随后加入5 μL FITC 和10 μL PI，室温避光染色5 min，最后加入1×Binding Buffer 100 μL 终止染色，于K2检测。实验重复3次。

1.5.7 Western blot 检测蛋白表达水平 取对数生长期的细胞，调整单细胞悬液浓度，均匀铺于100 mm培养皿，实验分组同“1.5.4”，处理48 h 后，PBS 清洗两遍，每皿加入80 μL 裂解液于冰上裂解30 min，离心（12 000 r/min，10 min）收集蛋白，定量，配制上样体系，于12% SDS-PAGE 胶电泳，转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，敷育一抗过夜，TBST 洗膜5次，每次6 min，室温敷育荧光二抗2 h，TBST 洗膜5次，每次6 min，于Odyssey-CLX 扫膜。实验重复3次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件处理数据，计量资料服从正态分布用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，满足方差齐性，多重比较采用LSD-t 检验，方差不齐者采用Dunnet T3检验；计量资料不服从正态分布采用秩和检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 齐墩果酸对A549细胞增殖的影响

MTT 法检测结果显示，不同浓度齐墩果酸组分别处理A549细胞24、48、72 h 后的细胞增殖率均低于对照组（P ＜0.01）。见图1。RTCA 结果显示，不同浓度齐墩果酸能够抑制A549细胞增殖。见图2。RTCA 和MTT 实验结果基本一致，选择增殖抑制效果较好的低浓度齐墩果酸（1.25、5 μmol/L）作用48 h 进行后续实验。

图1 MTT 法检测齐墩果酸对A549细胞增殖的影响（n=3）

2.2 齐墩果酸对A549细胞凋亡的影响

Hoechst 33342染色法结果显示，对照组细胞核染成均匀淡蓝色，而各加药组细胞部分细胞核呈颗粒状亮蓝色，伴有细胞核固缩、边集、碎裂等。与对照组比较，各加药组荧光强度明显增强，差异有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01）。见图3（封三）。JC-1染色结果显示，与对照组比较，各加药组染色后的红色荧光强度明显下降，绿色荧光强度显著增强（P ＜0.05或P ＜0.01），提示细胞线粒体膜电位下降。见图4（封三）。Annexin V-FITC/PI 双荧光染色结果显示，与对照组比较，各加药组细胞凋亡明显增加（P ＜0.05或P ＜0.01）。见图5。

图2 RTCA 监测齐墩果酸对A549细胞增殖的影响

图3 Hoechst 33342染色法检测齐墩果酸对A549细胞凋亡的影响(n=3,200 um,100x)

图4 线粒体膜电位检测齐墩果酸对A549细胞凋亡的影响(n=3,100μm,200x)

图5 流式细胞仪检测齐墩果酸对A549细胞凋亡的影响（n=3）

2.3 齐墩果酸对A549细胞增殖及凋亡相关蛋白表达水平的影响

齐墩果酸能够下调抗凋亡蛋白XIAP、Survivin、Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3、cleaved caspase 8的表达，与对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01）。见图6。

3 讨论

肺癌作为发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤，严重威胁了人们健康和生命安全，现常用的治疗手段，具有一定的局限性、昂贵的治疗费用、难以逆转的毒副作用等不容忽视的缺点，因此从安全性高、疗效确切、不宜耐药、相对廉价的中药入手，寻找更合适的治疗方法及药物是研究的重点。

在以往的研究中发现，齐墩果酸对肝癌[7]、乳腺癌[8]、胰腺癌[9]、结肠癌[10]、肺癌[11]等肿瘤细胞均有一定的作用，但在A549细胞方面相关研究较少且不够深入，有待进一步研究拓展。本研究通过MTT 及RTCA检测齐墩果酸对A549细胞增殖的影响，结果发现，不同浓度齐墩果酸对A549细胞增殖均有显著的抑制作用，且通过RTCA 图像可以初步判断齐墩果酸能够造成A549细胞DNA 损伤[12-13]使其失去复制能力，进而抑制其增殖。Hoechst 33342染色观察细胞形态，发现对照组呈均一的淡蓝色，齐墩果酸干预的实验组部分细胞核呈颗粒状亮蓝色，并伴有细胞核固缩、边集、碎裂，出现凋亡小体等明显的凋亡特征。有研究显示，齐墩果酸可以下调线粒体膜电位促进细胞凋亡[7]，本研究采用JC-1检测也发现，与对照组的红色荧光比较，随着齐墩果酸浓度的提高绿色荧光的占比也随之升高，提示线粒体膜电位降低，出现细胞凋亡。同时流式细胞仪检测结果显示，与对照组比较，不同浓度齐墩果酸均能诱导A549细胞凋亡，以早期凋亡为主，高浓度组的抑制率优于低浓度组。已有研究提示，齐墩果酸的诱导凋亡作用主要通过调节Bcl-2家族表达[14]、上调抑癌基因p53的表达[15]、诱导活性氧的产生[16]等途径发挥作用。本研究发现，齐墩果酸可以抑制A549细胞Bcl-2表达、上调Bax 表达。另外，本研究还发现，齐墩果酸可以下调A549细胞XIAP 和Survivin 的表达。XIAP[17]和Survivin[18]是凋亡抑制蛋白家族的两个重要成员，许多中药单体，如阿魏酸[19]、白藜芦醇[20]等均通过下调其表达发挥抗肿瘤作用。以上均表明齐墩果酸可以诱导A549细胞凋亡。根据以上结果推测齐墩果酸可能通过诱导A549细胞凋亡抑制细胞增殖。

另外，研究显示，齐墩果酸可以激活caspase 蛋白酶家族[21]，进一步实验表明，齐墩果酸处理后A549细胞中cleaved caspase 3和cleaved caspase 8均表达上调。死亡受体途径由caspase 8直接激活caspase 3或是caspase 8通过激活Bid 增加线粒体通透性触发线粒体释放促凋亡因子激活caspase 3导致细胞凋亡。线粒体途径可能是通过DNA 损伤等激活Bcl-2家族促凋亡因子增加线粒体的通透性进而导致细胞凋亡。因此，推测齐墩果酸可能是通过死亡受体途径或线粒体途径诱导A549细胞凋亡，具体机制有待进一步研究。

图6 齐墩果酸对A549细胞增殖及凋亡相关蛋白表达水平的影响（n=3）

综上所述，齐墩果酸可能通过死亡受体途径或线粒体途径诱导A549细胞凋亡，抑制其增殖。