蓬子菜水溶液治疗糖尿病性大鼠慢性皮肤溃疡的效果及其最佳治疗浓度研究

苑海刚 赵 钢 贾 振 吕勃川 黄艳红 张百亮 姜德友 王学军

1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江哈尔滨 150036；2.黑龙江中医药大学附属第一医院周围血管病科，黑龙江哈尔滨 150040

慢性皮肤溃疡（CSU）大多由循环障碍、外伤、感染等因素所导致皮肤组织缺损[1-3]，组织缺损可深达真皮或皮下层，且病情迁延反复难愈，严重影响患者的生活质量和身心健康[4-6]，重者可继发全身严重感染或危及生命。目前，临床多采用局部创面的清创、换药疗法，但促进溃疡愈合作用有限。黑龙江中医药大学附属第一医院（以下简称“我院”）周围血管病科临床研究发现，蓬子菜水溶液局部外用治疗下肢CSU 能够明显促进愈合[7]，但对治疗慢性皮肤溃疡的最佳治疗浓度未做进一步深入的研究。本研究通过建立糖尿病性大鼠CSU 模型，用不同浓度蓬子菜水溶液对皮肤溃疡病灶进行治疗，观察对大鼠皮肤溃疡病灶的治疗作用，并对蓬子菜水溶液具体用药浓度进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康的Wistar 雄性大鼠60只，鼠龄6～8周，体重250～300 g，由黑龙江中医药大学动物实验安全中心提供且已通过实验动物伦理委员会批准，许可证号：SCXK2008004。每5只1笼分开饲养，按时喂饲料、饮水、更换垫料，保持饲养室卫生清洁、适宜的温湿度及通风。

1.2 主要试剂

2%戊巴比妥钠（上海试剂二厂，生产批号：820219）；贝复济重组牛碱性成纤维细胞生长因子（珠海亿胜生物制药有限公司，生产批号：09181101，63000 U/瓶）；蓬子菜水溶液（黑龙江中医药大学制剂室，生产批号：980316，规格：10 mL/支，含生药0.3 g）。称取适量的蓬子菜干燥全草，用10倍量蒸馏水浸泡30 min，煎煮2次，每次1.5 h，煎液经滤过、浓缩、冷却、离心后滤取上清液，灌封，灭菌而得。

1.3 主要仪器

电子天平（瑞士Mettler 公司），绝对精度为千分之一；超净工作台（北京医疗设备厂）；低温冰箱（日本三洋公司）；光学显微镜、切片机、包埋机、脱水机、烤片机等设备（德国Leica 公司）；无菌透明生物膜（香港施乐辉有限公司）。

1.4 动物模型制备

健康的Wistar 雄性大鼠60只自然喂养2 d，实验前禁食12 h 后，链脲佐菌素按55 mg/kg 给药一次性腹腔注射，72 h 后尾部采血测血糖，连续3次随机血糖浓度≥16.8 mmol/L 时，视为糖尿病模型建立成功。2%戊巴比妥按2～3 mL/kg 给药一次性腹腔注射麻醉后，将大鼠左侧背部术区备皮，固定于手术台上。碘伏消毒术区，按外科无菌操作在大鼠左侧背部制备直径为2 cm 的圆形皮肤缺损，深达皮下层，模拟临床无法自行愈合的慢性皮肤溃疡创面，无菌手术敷贴加压包扎创面。见图1。

图1 糖尿病大鼠慢性皮肤溃疡模型

1.5 实验大鼠分组及治疗

采用随机数字表法将造模的60只Wistar 大鼠随机均分为6组：高浓度（30 mg/mL）、中浓度（3 mg/mL）、低浓度蓬子菜治疗组（0.3 mg/mL）、阴性对照组、模型对照组、贝复济组，每组10只，各组分笼饲养。术后第1天高、中、低浓度蓬子菜治疗组和对照组大鼠创面分别进行常规碘伏消毒，生理盐水冲洗，无菌纱布拭净水分。高、中、低浓度蓬子菜治疗组分别喷洒相应浓度的蓬子菜水溶液，阴性对照组喷洒生理盐水，贝复济组喷洒贝复济溶液治疗。给药量分别为：高浓度蓬子菜治疗组50 mg/cm2、中浓度蓬子菜治疗组5 mg/cm2、低浓度蓬子菜治疗组0.5 mg/cm2，阴性对照组生理盐水2 mL/cm2，贝复济组喷洒贝复济溶液262.5 U/cm2。待药物逐渐吸收后，无菌手术敷贴包扎伤口，每日治疗1次，连续治疗10 d。

1.6 剩余溃疡面积计算

分别于造模术后3、7、10 d 用无菌透明生物膜覆盖创面并沿创缘进行描膜，将图像输入计算机后用Image J 软件计算溃疡剩余面积。

1.7 溃疡创面的病理检查

造模术后10 d 将各组大鼠处死，切取背部创面组织，置于10%甲醛溶液中存放。用石蜡包埋后切片，HE 染色，光镜下观察病理组织学改变。

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对实验数据进行分析。实验数据以均数±标准差（）表示，采用重复测量方差分析，两两比较采用t 检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察

所有造模的大鼠均于麻醉后2～3 h 苏醒，并能够自由活动进食水。治疗期间大鼠精神状态及食欲良好，体重稳定增加。术后各组溃疡面均逐渐缩小，未出现感染。

2.2 不同时间点各组大鼠溃疡面积的比较

整体分析发现：高、中、低浓度蓬子菜治疗组和贝复济组比较，组间和时间差异有统计学意义（P ＜0.05），且存在交互作用。进一步两两比较：与造模后3 d 比较，高、中、低浓度蓬子菜治疗组和贝复济组造模后7、10 d 溃疡面积明显缩小，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与造模后7 d 比较，高、中、低浓度蓬子菜治疗组和贝复济组造模后10 d 溃疡面积明显缩小，差异有统计学意义（P ＜0.05）。造模后3、7、10 d 高、中、低蓬子菜治疗组和贝复济组大鼠溃疡面积均明显小于阴性对照组和模型对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；造模后3、7、10 d 高、中、低蓬子菜治疗组大鼠溃疡面积明显小于贝复济组，差异有统计学意义（P ＜0.05），中浓度蓬子菜治疗组创面缩小最为明显，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 不同时间点各组大鼠溃疡面积的比较（cm2，）

表1 不同时间点各组大鼠溃疡面积的比较（cm2，）

注：与同期阴性对照组比较，aP ＜0.05；与同期模型对照组比较，bP ＜0.05；与同期贝复济组比较，cP ＜0.05；与同期中浓度蓬子菜治疗组比较，dP ＜0.05；与同组造模后3 d 比较，eP ＜0.05；与同组造模后7 d 比较，fP ＜0.05

2.3 组织病理学观察

阴性对照组和模型对照组创面光镜下可见：表皮结构不完整，腺体及毛囊结构缺失，炎症细胞较多；真皮组织水肿明显，炎症细胞较多，增生的毛细血管较少，结缔组织增生不明显。见图2A～B。贝复济组创面光镜下可见：炎症细胞浸润较对照组明显减少，新生肉芽组织及纤维结缔组织较对照组明显。见图2C。蓬子菜治疗组创面光镜下可见：高、中、低浓度蓬子菜治疗组均比贝复济组创面肉芽组织生长明显，表皮层炎症细胞较少；真皮层毛细血管丰富，炎症细胞较少，结缔组织增生明显。见图2D～F。中浓度蓬子菜治疗组创面新生肉芽组织及结缔组织明显优于其他组。

3 讨论

图2 造模术后10 d 实验各组背部创面组织病理组织学改变HE 染色（400×）

慢性皮肤溃疡属中医“疮疡”的范畴，多见于老年人，主要包括糖尿病性溃疡[8-9]、外伤性溃疡、感染性溃疡等几大类。无论哪种病因引起的慢性皮肤溃疡，均可导致溃疡灶局部血液循环障碍、周围组织明显水肿且处于缺血缺氧状态[10]。溃疡灶有大量炎症细胞浸润，影响组织的再生及修复，影响溃疡灶的愈合。目前西医主要采用激光、微波照射、外源性应用表皮生长因子等方法治疗慢性皮肤溃疡，然而作用甚微。外科也采用植皮手术来治疗慢性皮肤溃疡，但成活率低，且加重患者的痛苦和经济负担。疮疡的中医外治法历史悠久、经验丰富、手段多样、效果显著。现今从祖国传统医学中寻求适当的药物及疗法，并结合现代药理学研究，逐渐成为国内外研究热点。

蓬子菜（Galium verum L.）为茜草科多年生草本植物的全草，它富含绿原酸和黄酮类等物质[11-12]，广泛分布于自然界中，主要分布于我国东北、西北等地。药性温和，味苦甘，药理学研究证实其清热解毒、活血化瘀、除湿止痒之功效[13-14]，可内服亦可外用，已被黑龙江省药品标准所收载。民间早期用于治疗慢性肝炎、荨麻疹、稻田皮炎、跌打损伤、妇科血气痛等疾病，效果满意。后期大量研究发现，蓬子菜对急性痔发作、下肢深静脉血栓[15-16]、下肢静脉炎[17]、下肢血栓闭塞性脉管炎[18]、下肢动脉硬化闭塞症[19]、下肢慢性皮肤溃疡[20]均有较好的治疗作用。黑龙江中医药大学李令根教授潜心研究，应用蓬子菜治疗周围血管病已有30多年的历史，效果甚佳。李令根教授研制以蓬子菜为主要成分的康脉系列：康脉2号胶囊（由蓬子菜、茯苓、黄柏、苍术、三棱、莪术、甘草等中草药精制而成）、康脉3号胶囊（由蓬子菜、路路通、土茯苓、茯苓、虎杖、甘草等中草药精制而成）、脉乐冲剂（主要由蓬子菜、黄芪、苦参、当归、土茯苓组成）等药物已成为我院周围血管病科的常规用药。

本研究探讨各组大鼠造模后不同时间点的皮肤溃疡病灶面积变化和病理组织学形态改变，发现高、中、低浓度蓬子菜治疗组和贝复济组不论从溃疡面积变化，还是病理组织学形态改变都明显优于模型对照组和阴性对照组，且高、中、低浓度蓬子菜治疗组均优于贝复济组。提示蓬子菜水溶液对慢性皮肤溃疡的愈合具有显著的促进作用，效果优于贝复济。此外，本研究证实中浓度蓬子菜治疗组与高、低浓度蓬子菜治疗组比较，效果更显著，即蓬子菜水溶液治疗慢性皮肤溃疡的最佳药物浓度为中浓度（3 mg/mL）。蓬子菜水溶液治疗慢性皮肤溃疡的具体作用机制仍待进一步深入研究，可能与清热解毒、活血化瘀、除湿止痒等功效密切相关，蓬子菜水溶液较贝复济有易于存储运输、经济适用、效果显著等诸多优点，值得临床推广应用。