黑曲霉液体发酵香菇残次品产纤维素酶的培养基优化

殷 休，袁 博，刘应保，高梦祥

（长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 404325）

食用菌是具有高等子实体的一类大型真菌，其种类、数量繁多，富含多种活性成分，具有提高人体免疫力，抗肿瘤、降血脂等保健功效[1-4]。我国是食用菌生产大国，2017 年全国食用菌产量为3 712万t，其中香菇产量为986.51万t，产值为2 721.92亿元，约占世界食用菌总产量的70%以上[5]。香菇味道鲜美，营养丰富，是我国著名的食用和药用菌。目前，国内外都很重视香菇功能性成分的开发，如香菇呈味物质[6]、香菇多糖[7]、香菇挥发性风味物质[1，8]、香菇药理活性物质[9]以及香菇可溶性膳食纤维[10]等。由于香菇的采收季节性很强，采收后容易发生腐败，造成品质和营养价值的损失。目前，香菇的加工多是当地鲜销和制罐，其他类型的深加工产品很少[6，10]，同时残次香菇及伞柄等加工中的下脚料，被完全浪费掉了，虽然目前香菇及伞柄等加工中的下脚料作为发酵原料制作酒精[11]、葡萄酒[12]、饮料[10]和调味品[6]等。但是，其利用率还不高，产品的种类还不丰富且附加值高的产品偏少。所以，香菇的综合利用迫在眉睫，其开发前景广阔。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常见的曲霉属真菌，广泛分布在谷物、空气、土壤等，黑曲霉是公认安全的微生物[13]，且黑曲霉生长较快[14]，产酶周期短[15]，用其生产的酶，种类丰富、安全可靠、不产生毒素[15-16]，因此采用黑曲霉生产的纤维素酶特异性高，反应条件比较温和，能作用于香菇细胞壁，将蛋白质、功能性多糖等大分子物质释放出来[17]。

本试验以香菇残次品为主要原料，采用黑曲霉产纤维素酶液体发酵，对黑曲霉产纤维素酶的培养基组成进行了研究，探讨了不同培养基组成对所产纤维素酶活的影响，为香菇的综合利用提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger）：由长江大学微生物实验室提供。

1.1.2 化学试剂

羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）、柠檬酸、3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS），氢氧化钠，葡萄糖，柠檬酸三钠、盐酸、酒石酸钾钠、苯酚（重蒸）、无水亚硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司。实验所用化学试剂均为分析纯。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：将马铃薯去皮、洗净、切成小块，称取200 g加入1 000 mL蒸馏水，煮沸20 min，用纱布过滤，滤液补足水至1 000 mL，再加入糖和琼脂，熔化后分装，pH 自然。121 ℃灭菌25 min。

纤维素培养基：CMC 5.0 g，Na2HPO46.0 g，K2HPO44.0 g，（NH4）SO42.0 g，琼脂15.0 g，矿物盐溶液500 mL，蒸馏水500 mL，pH 自然。121 ℃灭菌25 min。

1.2 仪器与设备

DL-5-C高速冷冻离心机：上海市离心机械研究所；ET-2010KA立式双门回旋摇床：金坛市亿通电子有限公司；UV-1800紫外分光光度计：日本岛津公司；HH-4恒温水浴锅、BS-IE振荡培养箱：国华电器有限公司；HFsafe-1200超净工作台：上海力申科学仪器有限公司；HVE-50立体式高压灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；YE4A349120移液枪：北京金花仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 孢子悬液的制备

吸取20 mL无菌水加入到黑曲霉斜面试管上，用接种环将试管斜面上的孢子轻轻刮下，倒入带有四层擦镜纸的灭菌漏斗中过滤，然后将过滤的黑曲霉菌液倒入灭菌盛有小玻璃珠的50 mL三角瓶中，重复3次，30 ℃、150 r/min振荡培养15 min，将孢子充分打散，得到单孢子悬液。

1.3.2 培养方法

将香菇残次品切成丁，加入一定量的蒸馏水，用高速匀浆机打成浆，采用121 ℃高压汽灭菌30 min，冷却，接入2 mL的黑曲霉孢子悬液，在30 ℃发酵一定时间后取发酵液，10 000 r/min离心10 min，取上清液测定纤维素酶活。

1.3.3 葡萄糖标准曲线的制作[16]

在不同浓度的标准葡萄糖溶液中各加入DNS溶液1.5 mL，混合液于沸水浴中煮沸5 min，冷却后加蒸馏水定容至25 mL，摇匀，在波长540 nm处测定光密度（OD540nm）值，并以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标（x），OD540nm值为纵坐标（y）绘制葡萄糖标准曲线，得到葡萄糖标准曲线回归方程：y=0.464 7x-0.047 0（R2=0.983 4）。

1.3.4 纤维素酶酶活测定

纤维素酶活测定采用还原糖法即CMC-DNS法[16，18-19]。取发酵后的粗酶液1 mL，加到2 mL、1%的CMC溶液（pH 4.8的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液配制），于50 ℃恒温水浴中反应0.5 h，取出加入3 mL DNS显色液，沸水浴10 min测定还原糖的含量。羧甲基纤维素酶活力（sodium carboxymethyl cellulose activity，CMCA）计算公式如下：

式中：X表示羧甲基纤维素酶活力，U/mL；m表示从标准曲线查得的葡萄糖含量，mg；N表示酶液稀释倍数，2表示时间单位换算。

羧甲基纤维素酶活力定义：1 g固体酶（或1 mL液体酶），在（50±0.1）℃、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH 4.8，中性纤维素酶pH 6.0），1 h水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量为1个酶活力单位（U/mL）。

1.3.5 黑曲霉产纤维素酶曲线

将2 mL黑曲霉单孢子悬液接入到50 mL香菇液体培养基中，在30 ℃下、150 r/min振荡培养。从第2天起，每隔24 h取样，测定发酵液的纤维素酶活，绘制黑曲霉产纤维素酶曲线，确定黑曲霉液态发酵时间。

1.3.6 培养基成分优化单因素试验

香菇与水料水比对产纤维素酶活的影响：分别按照香菇与水料水比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g∶mL），接入2 mL的孢子悬液进行发酵培养，30 ℃、150 r/min振荡培养120 h后测定酶活。

麦芽糖添加量对产纤维素酶活的影响：在香菇液培养基中加入麦芽糖，使其质量浓度分别为0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L，接入2 mL的孢子悬液进行发酵培养，30 ℃、150 r/min振荡培养120 h后测定酶活。

蛋白胨添加量对产纤维素酶活的影响：在香菇液培养基中加入蛋白胨，使其质量浓度分别为0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L，接入2 mL 的孢子悬液进行发酵培养，30 ℃、150 r/min振荡培养120 h后测定酶活。

酵母膏添加量对产纤维素酶活的影响：确定最佳麦芽糖和蛋白胨的添加量基础上，在香菇液培养基中加入酵母膏，使其质量浓度分别为0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L，接入2 mL 的孢子悬液进行发酵培养，30 ℃、150 r/min振荡培养120 h后测定酶活。

1.3.7 培养基成分优化响应面试验

选取香菇与水料水比（A）、麦芽糖添加量（B）、蛋白胨添加量（C）、酵母膏添加量（D）4个因素进行响应面（Box-Behnken）试验设计，以羧甲基纤维素酶酶活（Y）为响应值，其因素水平设置见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 结果与分析

2.1 黑曲霉产纤维素酶曲线

发酵液的纤维素酶活随发酵时间的变化结果见图1。由图1可知，随着发酵时间在48～120 h范围内的延长，黑曲霉在香菇培养基中产纤维素酶活随之增加，并在发酵时间120 h时达到最高，为9.21 U/mL，发酵时间＞120 h 之后呈平稳趋势。因此，黑曲霉产纤维素酶最佳发酵时间为120 h。

图1 黑曲霉产纤维素酶曲线Fig.1 Curve of cellulase production by Aspergillus niger

2.2 培养基成分优化单因素试验

2.2.1 香菇与水比例对产纤维素酶活的影响

不同的香菇与水比例对纤维素酶活的影响结果见图2。由图2可知，香菇与水比例为1∶6～1∶10（g∶mL）范围时，纤维素酶活逐渐增加；香菇与水比例为1∶10（g∶mL）时，纤维素酶活最高，为9.37 U/mL；香菇与水比例在1∶10～1∶14（g∶mL）范围时，纤维素酶活逐渐降低。因此，香菇与水比例1∶10（g∶mL）为宜。

图2 香菇与水比例对黑曲霉产纤维素酶的影响Fig.2 Effect of Lentinus edodes to water ratio on cellulase production by Aspergillus niger

2.2.2 麦芽糖添加量对产纤维素酶活的影响

前期预实验发现，在麦芽糖、葡萄糖、乳糖和蔗糖这4种碳源的情况下，黑曲霉产酶对麦芽糖作为碳源的利用效果最高。麦芽糖添加量对纤维素酶活的影响结果见图3。由图3可知，随着麦芽糖添加量的增加，纤维素酶活也在增加。达到1 g/L 时，纤维素酶活为9.48 U/mL，再增加其添加量对纤维素酶活影响并不显著。考虑到成本，因此，选择麦芽糖添加量1 g/L为最佳。

图3 麦芽糖添加量对产纤维素酶活的影响Fig.3 Effect of maltose addition on cellulase production by Aspergillus niger

2.2.3 蛋白胨添加量对产纤维素酶活的影响

前期预实验发现，在蛋白胨、尿素、硫酸铵和硝酸钠这4种氮源的情况下，黑曲霉产酶对蛋白胨作为氮源的利用效果最高。蛋白胨添加量对纤维素酶活的影响结果见图4。由图4可知，随着蛋白胨添加量的增加，纤维素酶活也在增加。达到0.75 g/L 时，纤维素酶活为9.95 U/mL，再增加其添加量对纤维素酶活影响并不显著。考虑到成本，因此，选择蛋白胨添加量0.75 g/L为最佳。

图4 蛋白胨添加量对产纤维素酶活的影响Fig.4 Effect of peptone addition on cellulase production by Aspergillus niger

2.2.4 酵母膏添加量对产纤维素酶活的影响

酵母膏作为生长因子，其添加量对纤维素酶活的影响结果如图5所示。由图5可知，随着酵母膏添加量的增加，纤维素酶活也在增加。达到0.75 g/L时，纤维素酶活为10.19 U/mL，再增加其添加量对纤维素酶活影响并不显著。考虑到成本，因此，选择酵母膏添加量0.75 g/L为最佳。

图5 酵母膏添加量对产纤维素酶活的影响Fig.5 Effect of yeast extract addition on cellulase production by Aspergillus niger

2.3 响应面试验设计及分析

选取香菇与水料水比（A）、麦芽糖添加量（B）、蛋白胨添加量（C）、酵母膏添加量（D）4个因素进行响应面（Box-Behnken）试验设计，以羧甲基纤维素酶酶活（Y）为响应值，Box-Behnken试验方案及结果见表2，方差分析见表3。

表2 Box-behnken试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-behnken experiments

通过Design Expert 8.0软件对数据进行二次回归拟合，获得香菇与水料水比、麦芽糖、蛋白胨和酵母膏对纤维素酶活的二次回归方程：

表3 二次回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic regression model

由表3可知，该模型P=0.002 5＜0.01，失拟项P＞0.05，表明该模型回归显著，失拟性不显著，因而无失拟因素存在。一次项A、D、交互项AB、BC、CD、二次项B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）。回归方程决定系数R2=0.917 5，调整决定系数R2adj=0.835 1，表明方程拟合较好。变异系数（coefficient of variation，CV）=8.23%，表示试验的精确度较高，试验操作可信。

Design Expert8.0软件得到三维响应面分析见图6。等高线的形状可以反映因素间交互作用的强弱大小，圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著。由图6可知，麦芽糖与香菇与水料水比、麦芽糖与蛋白胨、酵母膏与麦芽糖的交互作用等高线均呈椭圆形，表明以上交互作用均对纤维素酶活影响显著。

为当麦芽糖量固定时，纤维素酶活随着香菇与水料水比呈先增大后减小的趋势；当香菇与水料水比固定时，纤维素酶活随麦芽糖量的增加也呈先增大后减小的趋势。

当麦芽糖量固定时，纤维素酶活随着蛋白胨量呈先增大后减小的趋势；当蛋白胨量固定时，纤维素酶活随麦芽糖量的增加也呈先增大后减小的趋势。

图6 各因素交互作用对黑曲霉产纤维素酶影响的响应面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on cellulase production by Aspergillus niger

当酵母膏量固定时，纤维素酶活随着麦芽糖量呈先增大后减小的趋势；当麦芽糖量固定时，纤维素酶活随着酵母膏量也呈先增大后减小的趋势。

2.4 最佳培养条件的确定及其验证实验

对回归方程求解，得到最佳发酵培养基组成为：香菇与水比例为1∶9.09（g∶mL），麦芽糖添加量为0.91 g/L，蛋白胨添加量为0.66 g/L，酵母膏添加量为0.50 g/L。纤维素酶活预测值为12.95 U/mL。为方便实际操作，调整发酵培养基组成为：香菇与水比例为1∶9（g∶mL），麦芽糖添加量为0.9 g/L，蛋白胨添加量为0.7 g/L，酵母膏添加量为0.5 g/L进行发酵产纤维素酶3次验证实验，测得纤维素酶活平均值为13.15 U/mL，预测误差为1.52%。表明培养基优化模型是有效的。

3 结论

在纤维素酶的生产过程中，影响酶产量的因素很多，这些因素之间不是孤立的，而是相互联系的。本研究选取香菇与水料水比、麦芽糖添加量、蛋白胨添加量和酵母膏添加量4个因素，利用响应面法来优化黑曲霉产纤维素酶的发酵培养基组成。结果表明，在培养基组成为香菇与水比例为1∶9（g∶mL），麦芽糖添加量为0.9 g/L，蛋白胨添加量为0.7 g/L，酵母膏添加量为0.5 g/L的条件下，发酵得纤维素酶活为13.15 U/mL，比培养基未优化前提高了22.5%。表明用这种方法来优化黑曲霉产纤维素酶的发酵培养基，能够使酶活得到一定的提高，为香菇残次品的综合利用提供了一定的理论依据。