降脂合剂的质量标准研究

黄和军，杨军辉，陈国宝，蒋赢，俞宾，柳佳，李书霖

(1.南京中医药大学江阴附属医院，江苏 江阴 214400; 2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

随着经济的发展和人民生活水平的提高，“富贵病”比如糖尿病、高脂血症等发病率越来越高，近30年来我国国民“高脂血症”的发病率已经超过了40%，西医治疗主要以他汀、贝特类为主，疗效确切，但肝损伤、肌溶解等安全性问题不容小视。中医药治疗高脂血症有着其独特的优势，但对于本病的辨证分型尚未达成统一，各医家常根据自己的辨证模型遣方用药。邢祝乔等[1]运用疏肝、健脾、补肾、化痰方法辨证施治，郭海山[2]运用化痰降浊、活血化瘀、温肾健脾方法辨证施治，刘晶晶等[3]以健脾化痰、清胃热、活血化瘀、滋补肝肾、疏肝理气方法辨证施治，黄煌擅长运用大柴胡汤、五苓散、桂枝茯苓丸等经方进行辨治[4]。

我科常用自拟的降脂合剂用于治疗高脂血症。本方主要成分是紫丹参、泽泻、决明子、苍术、荷叶、枸杞子、山楂和石菖蒲，是江苏省名老中医袁士良的临床效方，用于健脾祛湿、化浊降脂、活血行气及补益肝肾。临床上适用于痰湿脂浊，痰阻血脉，气血瘀滞之高脂血症和脂肪肝，或伴有冠心病、肝功能不全、动脉粥样硬化等疾病。方中泽泻，归膀胱、肾经，功效利水渗湿、泄热、化浊降脂，具有降脂、降糖、降血压、抗脂肪肝、抗动脉粥样硬化等药理作用[5-6]。枸杞子，归肝、肾、心经，功效滋补肝肾、润肺、明目，有着改善血糖、调节血脂、抑制肿瘤、抑制动脉粥样硬化、增强免疫力等药理作用[7]。石菖蒲，归心、脾、膀胱经，功效化湿浊、醒脾胃、行气滞、消胀满，具有降脂、抗炎、镇静、增强免疫等药理作用[8]。决明子,走厥阴肝经，功效清肝明目、润肠通便，具有降脂降压、清肝明目、抗氧化等药理作用[9]。丹参，归心、心包、肝经，活血祛瘀、凉血消痈、养血安神，拥有抵抗动脉粥样硬化、调脂、保肝、防止血栓形成、改善心肌供血防止心肌缺血等药理作用[10-12]。苍术，入脾、胃经，功效燥湿健脾，山楂，入脾、肝经，功效消积破结，行血开瘀，苍术配山楂可有效调制糖脂代谢，明显降低甘油三酯及胆固醇[13]。荷叶，归肝、脾、胃经，形如仰孟，可升少阳清气、清暑利湿、凉血止血，现代药理研究荷叶提取物可通过影响脂肪酸合成代谢的相关蛋白而达到降低血脂的目的[14]。

根据中药新药6类标准拟开发降脂合剂成为医院制剂，为了更好的控制降脂合剂的质量，确保临床疗效，有必要建立制剂内部质量控制标准。本实验采用TLC法对降脂合剂中泽泻、枸杞子、石菖蒲和决明子进行薄层鉴别，采用HPLC法测定降脂合剂中丹酚酸B含量，为创设降脂合剂质量控制高标准提供科学实验研究依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪，VWD可变波长紫外检测器；SQP型十万分之一天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；XP-6型百万分之一天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(常州中捷实验仪器制造有限公司)；TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)；ZF-8暗箱三用紫外分析仪(上海贝伦仪器设备有限公司)。

1.2 试药

丹酚酸B对照品(批号：111562-201313，纯度：97.0%)；泽泻对比药材(批号：121081-201105)、枸杞子对比药材(批号：121072-201109)、石菖蒲对比药材(121098-201105)、决明子对比药材(121011-201109)均购自于中国药品生物制品检定研究院。甲醇、乙腈(色谱纯，Tedia公司)；水为娃哈哈纯净水；其它试剂都为分析纯(南京化学试剂有限公司)。

降脂合剂(批号：20180228、20180312、20180314)，缺丹参、泽泻、石菖蒲、枸杞子和决明子的阴性对照样品均由江阴市中医院制剂室生产。

降脂合剂制备方法：麸炒苍术75 g,石菖蒲30 g,山楂150 g,荷叶50 g,泽泻150 g,丹参75 g,炒决明子75 g,枸杞子75 g，以上八味，加8～12倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1.5 h，合并两次煎液，滤过，取上清液浓缩至近1 000 mL，相对密度为1.03～1.07(60℃)，加苯甲酸钠3 g,羟苯乙酯0.3 g溶解，搅匀，滤过，加水至1 000 mL，测定pH值、相对密度，合格后，灌装，流通蒸汽灭菌45 min，贴签，即得。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 枸杞子

取本品15 mL，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，挥干，用1 mL乙酸乙酯溶解残余物，作为供试品溶液。另外选择枸杞0.5 g作为对比药材，加35 mL水煮沸15 min，放冷，滤过，用15 mL乙酸乙酯萃取续滤液，分取乙酸乙酯层，挥干，残余物加入1 mL乙酸乙酯溶解，作为对比药材溶液。按照TLC法试验(《中国药典》2015年版四部通则0502)，分别取10 μL 供试品和对比药材溶液点在同一硅胶G薄层板上，把甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶5∶2)当作展开剂，展开、取出、晾干，并且摆放在波长为365 nm的紫外等下仔细观察。供试品的色谱图中，在和对比药材色谱对应的位置上，显示出相同颜色的荧光斑点。阴性对照没有干扰，结果见图1。

图1 枸杞子鉴别TLC图1.枸杞子对照药材；2～4.供试品溶液；5.缺少枸杞子的阴性对照

2.1.2 决明子

取本品20 mL，加入1 mL盐酸，水浴加热30 min ，放冷，使用乙醚萃取，共萃取2次，每次均为20 mL，然后将其与乙醚液合并，再挥干，加入1 mL三氯甲烷到残渣中让他它溶解，作为供试品溶液。另外选取决明子对照药材粉末1 g，加入10 mL甲醇，浸1 h，过滤，滤液挥干，残渣加水10 mL溶解，然后加盐酸1 mL，水浴中加热30 min，冷却后用乙醚进行2次萃取，每次萃取20 mL，将它与乙醚液合并，挥干后加1 mL三氯甲烷到残渣中使其复溶，作为对比药材溶液。遵照TLC法试验(《中国药典》2015年版四部通则0502)，分别取溶液10 μL，点在同一硅胶H薄层板上，把石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)作为展开剂，展开、取出、晾干。供试品的色谱中，在和对比药材色谱相对应的位置上，结果显示出颜色一致的斑点，阴性对照未被干扰，结果见图2。

图2 决明子鉴别TLC图1.决明子对照药材；2～4.供试品溶液；5.缺乏决明子的阴性对照

2.1.3 石菖蒲

取本品20 mL，用石油醚(60～90℃)萃取2次，每次萃取20 mL，将它和乙醚溶液混合，挥干，把1 mL石油醚(60～90℃)加入残渣中使其复溶，作为供试品溶液。另取石菖蒲0.5 g作为对照药材，加石油醚(60～90℃)20 mL，超声处理混合液0.5 h(工作频率40 kHz，输出功率250 W)，滤过，滤液挥干，加1 mL石油醚(60～90℃)到残渣中复溶，作为对比药材溶液。参照TLC法试验(《中国药典》2015年版四部通则0502)，分别取各溶液10 μL，将他们分别点在同一硅胶G薄层板上，把石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(8∶2)作为展开剂，展开、取出、晾干，使用波长365 nm的紫外光灯对其进行观察。发现在供试品的色谱里，在与对比药材色谱相对应的位置上，显示出颜色一致的荧光斑点，阴性对照无干扰，结果见图3。

图3 石菖蒲鉴别TLC图1.石菖蒲对照药材；2～4.供试品溶液；5.缺石菖蒲的阴性对照

2.1.4 泽泻

取本品30 mL，加入2 mL饱和氯化钠，混匀，用乙醚萃取2次，每次萃取30 mL，将它和乙醚液混合，挥干，加1 mL乙酸乙酯到残渣复溶，作为供试品溶液。另外取泽泻2 g作为对照组药材，加适量水，煎煮30 min，滤过，滤液浓缩到约20 mL，加入饱和氯化钠2 mL，混匀，用乙醚振摇提取2次，每次30 mL，与乙醚液混合，挥干，残渣加1 mL乙酸乙酯复溶，作为对照药材溶液。参照TLC法试验(《中国药典》2015年版四部通则0502)，各溶液均取10 μL，分别点在同一硅胶H薄层板上，把环己烷-乙酸乙酯-甲酸(10∶6∶0.2)作为展开剂，展开、取出、晾干，喷上荧光增强剂(10%硫酸乙醇液)，80℃烘到斑点清楚显色。供试品的色谱在与对照药材色谱相应的位置上，显示出颜色一致的斑点，阴性对照无干扰，结果见图4。

图4 泽泻鉴别TLC图1.泽泻对照药材；2～4.供试品溶液；5.缺乏泽泻的阴性对照

2.2 HPLC含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Sepax C18赛芬液相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为0.1%甲酸水-乙腈，程度洗脱0～30 min，20%～25%乙腈，流速为1 mL/min，检测波长为289 nm，柱温定为30℃。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备

把甲醇加入进精密称量的丹酚酸B对照品溶液里，即配制成每1 mL含410.8 μg的溶液。

2.2.2.2 供试品溶液的制备

在10 mL容量瓶中加入精密量取的降脂合剂1 mL，再加入200 μL 1 mol/L的盐酸溶液，并用75%的甲醇定容至刻度，超声(功率250 W，频率40 kHz)，放冷，摇匀，离心(12 000 r·min-1，10 min)取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备

依照制剂处方，取1 mL缺丹参的降脂合剂阴性对照样品，按供试品溶液制取方法，制取阴性对照溶液。

2.2.3 线性关系考察

精密吸取丹酚酸B对照品溶液(410.8 μg·mL-1)，用甲醇稀释依次制成浓度为410.8、205.4、102.7、51.35、25.68、12.84μg·mL-1对照品溶液，分别吸取10 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定，纵坐标、横坐标分别为峰面积值、丹酚酸B浓度，绘制标准曲线，Y=7.540 6X-5.812 4(r=0.999 9)，线性范围为12.84～410.8 μg·mL-1。

2.2.4 专属性

精密吸取10 μL对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件测定。结果显示在供试品溶液色谱峰中，阴性对照溶液在对应的保留时间内无吸收峰，而与丹酚酸B对照品相应的保留时间有吸收峰，说明阴性对照无干扰。结果见图5～7。

图5 丹酚酸B对照品HPLC图谱

图6 降脂合剂HPLC图谱

图7 缺丹参的阴性对照HPLC图谱

2.2.5 精密度

精密吸取丹酚酸B对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，不间断连着进6针，记录丹酚酸B峰面积，结果RSD为0.50%，提示仪器的精密度良好。

2.2.6 重复性

取批号为20180228的降脂合剂，按“2.2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。结果丹酚酸B的平均含量为1.12 mg·mL-1，RSD值为0.64%，说明该方法的重复性良好。

2.2.7 稳定性

取批号为20180228的降脂合剂，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0，2，4，6，8，12 h各取10 μL进样测定，计算丹酚酸B峰面积RSD，结果RSD为0.55%，提示供试品水溶液在12 h内保持稳定。

2.2.8 加样回收率

取批号为20180228的降脂合剂，精密移取0.5 mL，放入10 mL容量瓶中，加入0.53 mg丹酚酸B对照品，按“2.2.2.2”项下方法平行制取6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以10 mL中的绝对量算出加样回收率，计算公式：[(实测量-样品量)/对照品加入量]×100%，结果见表1。丹酚酸B的平均回收率为103.93%,RSD为1.94%，表明该方法的加样回收率良好。

表1 加样回收率实验结果(n=6)

2.2.9 样品测定

取不同批号的降脂合剂，按“2.2.2.2”项下作法制取供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，把样品中丹酚酸B的浓度计算出来，结果见表2。

表2 降脂合剂含量测定结果(n=3)

3 讨论

前期预试验我们分别考察了处方中苍术、泽泻、枸杞子、石菖蒲和决明子的TLC鉴别，结果发现苍术阴性制剂存在干扰，而泽泻、枸杞子、石菖蒲和决明子TLC中无阴性干扰，可特异性鉴别，故暂将此四味药的TLC鉴别作为该制剂质量标准控制项目。方中其他药味的TLC鉴别，之后将进一步对其展开研究。

HPLC含量测定中有机相考察了甲醇和乙腈两种，结果发现甲醇作为流动相样品分离度不佳，因此，本文选流动相选取乙腈。同时，该实验研究也研究了把0.1%甲酸、0.1%乙酸和0.1%磷酸作为流动相，但是考虑到磷酸盐一定程度上会损害高效液相仪器和色谱柱，权衡后还是选择了把0.1%甲酸作为流动相。

综上所述，本实验采用TLC法和HPLC法对降脂合剂分别进行了定性鉴别和定量分析，实验结果表明，所建立方法简单可行，为降脂合剂的质量控制提供了方法和依据。