HPLC一测多评法同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分含量

马国萍，陈 丹，朱仙慕，刘秀棉，洪丽婷，陈 思

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

一测多评法［1］（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）是指利用中药有效成分的内在函数关系和比例关系，在只测定一个成分的情况下，实现多个成分的同步测定，本法对于解决中药对照品制备困难或价格昂贵的状况具有实际的应用价值。玳玳（Citrus aurantium L.var daidai Tanaka）属芸香科柑桔亚属植物，为酸橙变种，药食同源中药［2］，在我国福建、四川、浙江等地都有栽培。课题组前期研究表明：由玳玳果分离制备的玳玳果黄酮提取物具有良好的降脂抗氧化作用，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷等为其主要效应组分，其中柚皮苷、新橙皮苷成分占总黄酮含量的60%以上［3-6］，但橙皮内酯水合物、枳属苷对照品较难获得。为有效控制玳玳果黄酮降脂提取物质量，利用HPLC一测多评法（QAMS）建立同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个主要效应组分柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷含量，并与HPLC外标法（ESM）结果比较，以期建立运用单一对照品，多指标组分群控制玳玳果黄酮降脂提取物质量，为玳玳果黄酮降脂提取物质量控制标准的制订提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2996 PDA检测器、Empower 3色谱工作站（美国Waters公司）；XS205十万分之一电子天平、AR2140万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ3200型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 柚皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，纯度＞98%，批号：110722-201111）；新橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，纯度＞98%，批号：111857-201001）；橙皮内酯水合物（实验室自制，纯度为98.9%）；枳属苷（实验室自制，纯度为98.7%）；玳玳果黄酮提取物（自制，总黄酮含量在803.7～887.9 mg／g），批号分别为 20181015（批 1）、20181114（批 2）、20181201（批 3））；乙腈为色谱纯；水为超纯水：其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷对照品适量，分别加甲醇溶解，制得质量浓度为0.597 mg／mL的新橙皮苷对照品溶液、质量浓度为0.518 mg／mL的柚皮苷对照品溶液、质量浓度为0.275 mg／mL的橙皮内酯水合物对照品溶液、质量浓度为0.328 mg／mL的枳属苷对照品溶液。

2.2 供试品溶液的配制 精密称取玳玳果黄酮降脂提取物约10.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 阴性对照品溶液的配制 取缺玳玳果黄酮降脂提取物的溶剂，按“2.2”项下同法操作，即得。

2.4 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱Lichrocart C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相 A 为乙腈，B为0.2%冰醋酸水溶液，梯度洗脱［0～10 min AB（22∶78）；10～20 min A-B（35∶65）；20～25 min A-B（48∶52）；25～30 min A-B（22∶78）］；流速 1.0 mL／min；检测波长 284 nm；柱温 30℃；进样量 10 μL。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷的色谱峰分离度均R＞1.5，理论塔板数按柚皮苷计大于3 000。结果见图1。

图1 对照品、阴性对照和供试品的HPLC色谱图

2.5 标准曲线制备及线性关系考察 分别精密吸取不同体积的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷对照品贮备溶液，制成不同浓度的系列混合对照品溶液。精密吸取系列混合对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，最小二乘法线性回归，绘制标准曲线。实验结果表明：柚皮苷浓度在31.377～159.188 μg／mL 范围内线性关系良好，回归方程为 Y＝1.656×107X-2.620×104（r＝0.999 5）；新橙皮苷浓度在63.632～208.123 μg／mL范围内线性关系良好，回归方程为Y＝1.899×107X-1.841×104（r＝0.999 8）；橙皮内酯水合物浓度在 3.899～12.241 μg／mL范围内线性关系良好，回归方程为Y＝9.090×106X-1.578×103（r＝0.999 6）；枳属苷浓度在 2.696～17.366 μg／mL范围内线性关系良好，回归方程为 Y＝1.490×107X-8.179×103（r＝0.999 4）。

2.6 精密度试验 分别精密吸取同一供试品溶液各 10 μL，连续进样 6 次，按“2.4”项下同法操作，测得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷峰面积 RSD分别为 0.34%、0.48%、0.92%、1.09%，结果表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批玳玳果黄酮降脂提取物（批号：20181114），分别精密称取 6 份，按“2.2”和“2.4”项下同法操作，测得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷的平均含量分别为288.50、368.70、26.04、15.05 mg／g，RSD 值 分 别 为 2.47% 、2.27%、2.40%、2.48%，结果表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取 10 μL 注入高效液相色谱仪，按“2.4”项下同法操作，记录柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷的峰面积值，计算得峰面积的 RSD值分别为 0.85%、0.42%、1.95%、1.29%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 取干燥至恒重的玳玳果黄酮降脂提取物，分别精密称取约5 mg（批号：2018 1114），共6份，精密加入适量对照品溶液（每1 mL含柚皮苷0.520 mg、新橙皮苷 1.501 mg、橙皮内酯水合物 0.275 mg、枳属苷 0.328 mg），按“2.2”“2.4”项下同法操作、测定，计算得柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷的平均回收率分别为97.99%、101.50%、98.21%、95.56%，RSD 分别为 2.07%、2.80%、2.92%、2.32%，结果表明方法准确度良好。

2.10 内参物的选择及相对校正因子的计算 精密吸取含4组分系列混合对照品溶液10 μL，连续进样 6 次，按“2.2”和“2.4”项下同法操作、测定，分别以新橙皮苷、柚皮苷（k）为内参物，峰面积数据代入公式（1）分别计算内参物与其他3个组分的相对校正因子（fkm）和RSD值，比较确定内参物。

式中fk为内参（柚皮苷或新橙皮苷）的相对校正因子，fm为其他3个待测组分如新橙皮苷或橙皮内酯水合物或枳属苷的相对校正因子，Wm为待测组分的量，Am为待测组分的峰面积值，Wk为内参的量，Ak为内参的峰面积值。

2.1 0.1 以新橙皮苷为内参物 通过HPLC外标法测定一系列不同浓度的对照品溶液及对应的峰面积，按“2.10”项下公式（1），计算各成分与内参物新橙皮苷的相对校正因子，计算出相应的平均值，并计算RSD。见表1。

2.1 0.2 以柚皮苷为内参物 通过HPLC外标法测定一系列不同浓度的对照品溶液及对应的峰面积，以柚皮苷为内参物，按“2.10”项下公式（1），计算各成分与内参物柚皮苷的相对校正因子，计算出相应的平均值，并计算RSD。见表2。

2.11 样品含量测定 分别取三批玳玳果黄酮降脂提取物，按“2.2”和“2.4”项下同法操作、测定。 采用ESM、QAMS分别测定玳玳果黄酮降脂提取物中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷的含量。QAMS分别以新橙皮苷、柚皮苷为内参物应用公式（2），计算玳玳果黄酮提取物中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷的含量。定量公式（2）由公式（1）导出。结果见表3、表4。

式中，Wm为待测组分的量，Am为待测组分的峰面积值，Wk为内参的量，Ak为内参的峰面积值，fkm为内参k与待测组分m相对校正因子。

表1 以新橙皮苷为内参物的fk／m测定结果

表2 以柚皮苷为内参物的fk／m测定结果

表3 以新橙皮苷为内参物的QAMS与ESM含量测定结果比较（n＝3，Q／RSD%）mg／g

表4 以柚皮苷为内参物的QAMS与ESM含量测定结果比较（n＝3，Q／RSD%）mg／g

2.12 QAMS与ESM测定结果比较 取三批玳玳果黄酮降脂提取物，以QAMS计算4个效应组分含量，与采用ESM测得的各效应组分含量比较，考察QAMS的准确度。结果表明：以新橙皮苷为内参物时，QAMS与ESM的测定结果无显著性差异（P＞0.05），同样，以柚皮苷为内参物时，两种方法的测定结果也无显著性差异（P＞0.05），提示建立的 QAMS计算结果准确可靠，可用于玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分含量测定。同时，考虑到柚皮苷对照品较新橙皮苷对照品更为经济，故确定选择以柚皮苷为内参物的QAMS，建立同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个主要效应组分含量测定。见表3、表4。

2.13 QAMS法与ESM测定结果的统计分析评价采用SPSS 18.0软件的相关系数法，分别对三批玳玳果黄酮降脂提取物的4个效应组分平均含量测定结果进行线性回归分析，利用Pearson相关系数评价结果。比较两种方法测得结果的相关性，并计算相对误差，判别QAMS用于玳玳果黄酮降脂提取物中4个效应组分同步含量测定结果的准确性与差异性。结果表明：采用QAMS同时测定玳玳果黄酮降脂提取物中4个效应组分含量与ESM分别测定的含量结果呈正向直线相关（P＜0.05），QAMS和ESM测定的4个效应组分含量结果无显著性差异（P＞0.05），因此以柚皮苷或新橙皮苷为内参物的QAMS用于玳玳果黄酮降脂提取物多指标成分群的质量控制评价是可行的。

3 讨 论

实验曾比较乙腈-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.2%冰醋酸水溶液的等度洗脱与梯度洗脱程序。结果表明：以乙腈-0.2%冰醋酸水溶液为流动相，梯度洗脱，供试品中各组分均达基线分离且峰型良好，各组分的保留时间、峰面积的稳定性和重复性良好。

比较不同柱温（20、25、30、35 ℃）对色谱峰分离的影响，结果表明：在柱温30℃，进样量10 μL条件下，基线平稳，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷色谱峰峰形完整且稳定，各色谱峰达到完全分离。另外，曾考察不同品牌色谱柱、不同高效液相色谱仪对色谱峰定位及色谱响应因子（CRF）值稳定性影响，结果表明：在不同高效液相色谱仪上使用 Lichrocart C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行分析测定时，各组分的峰型均良好且CRF值稳定，故选择采用该色谱柱建立玳玳果黄酮降脂提取物的同步测定4个效应组分的HPLC一测多评法。

课题组前期研究表明：玳玳果黄酮降脂提取物的主要效应组分为柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷等，采用常规的外标法建立玳玳果黄酮降脂提取物的含量测定方法，同时测定4个效应组分含量，需要4个对照品，因橙皮内酯水合物、枳属苷对照品缺乏且价格昂贵，所以实验分别选取对照品简便易得且含量较高的新橙皮苷、柚皮苷作为内参物，计算4个效应组分含量。与采用ESM测得的各效应组分含量比较，两种方法的测定结果间均无显著性差异。在此基础上，综合考虑因柚皮苷对照品较新橙皮苷对照品更为经济，故选择柚皮苷为内参物，建立同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个主要效应组分的QAMS，使适合中药玳玳果降脂提取物多组分、多层次、多靶点的特性，达到多指标质量控制的目的。

实验利用玳玳果黄酮降脂提取物主要效应组分间的相互关系，建立QAMS同步测定提取物4个效应组分含量，判别QAMS用于玳玳果黄酮降脂提取物中4个效应组分同步含量测定结果的准确性与差异性。结果表明：采用ESM与QAMS法测定的含量结果呈正向直线相关，计算的含量结果之间没有显著性差异，验证了QAMS的准确性。研究建立的QAMS准确可靠，简便可行，可用于玳玳果黄酮降脂提取物的多指标质量的定量监控。