NRP2mAb 对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及黏附作用的影响研究

杨爱洁，李鹏，于洁，王凯，阎超#

1山东大学齐鲁医院青岛院区放疗科，山东 青岛 266000

2青岛大学附属医院医学工程科，山东 青岛 266000

乳腺癌是女性发病率最高的一种恶性肿瘤，近年来，其发病率呈年轻化趋势。随着医疗技术的不断进步，乳腺癌患者的整体疗效得到了明显提高，但患者术后复发率仍较高，晚期乳腺癌患者的病死率居高不下。而乳腺癌的早期发现有助于临床采取合理的诊疗措施，进而改善患者的预后。神经纤毛蛋白2（neuropilin 2，NRP2）属于一种糖蛋白分子，其分子量为110～140 kD，定位于染色体2q34，与淋巴系统密切相关，能够促进淋巴管内皮细胞的生长。NRP2在淋巴系统形成中发挥着重要作用，能够促进肿瘤细胞发生淋巴结转移。在乳腺癌、肺癌、胃肠道恶性肿瘤、胶质瘤及生殖系统恶性肿瘤中，NRP2存在广泛表达[1]。相关研究显示，NRP2在乳腺癌中高表达，参与了乳腺癌的发生、发展，与乳腺癌细胞的淋巴结转移密切相关[2]。NRP2单克隆抗体（neuropilin 2 monoclonal antibody，NRP2mAb）能够对NRP2结合位点进行抑制，从而抑制其相关生物学功能。本研究探讨了NRP2mAb对乳腺癌细胞的生物学作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器

人乳腺癌细胞株（MDA-MB-231）、NRP2mAb均由山东大学实验室提供，胎牛血清购自美国Gibco公司，DMEM培养基购自美国Gibco BRL公司，纤连蛋白（fibronectin，FN）购自美国R&D公司，吉姆萨染色液购自北京索莱宝公司；多孔板购自美国Costar公司，Transwell-24膜嵌套（小室）购自美国Corning公司，DYY-8C型电泳仪购自北京市六一仪器厂，CX31显微镜及FV1000激光共聚焦显微镜购自日本OLYMPUS公司，流式细胞仪购自德国Partec GmbH公司。

1.2 细胞培养

将MDA-MB-231细胞置于37℃温水中，1200r/min离心5 min后，置于孵育箱中培养复苏；而后经细胞传代处理后冻存。

1.3 细胞增殖抑制实验

以含10%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、NaHCO3、青霉素、氯霉素的DMEM培养基制成MDA-MB-231单细胞悬液，取200 μl单细胞悬液调整细胞浓度为3000/孔，接种于48孔板中；随后将其分为5组，每组8孔，分别采用25、50、75、100、200 μg/ml的NRP-2mAb处理5组MDA-MB-231细胞，随后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养1～3 d。采用 CCK-8法对 NRP2mAb处理 24、48、72 h时MDA-MB-231细胞的增殖抑制率进行检测。

1.4 细胞迁移实验

取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，经2%FBS饥饿处理1天，消化、洗涤及离心处理后，采用无血清培养基重悬细胞，取MDA-MB-231细胞悬液加入Transwell小室上室，同时分别采用0、25、50、75 μg/ml的 NRP2mAb 处理 MDA-MB-231细胞，在Transwell小室下室中加入含10%FBS的DMEM培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中孵育2天；移去小室内培养基，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2次，并以棉签擦净未迁移的MDA-MB-231细胞，采用瑞氏吉姆萨染色、处理15 min后，采用PBS洗涤2次，在光镜下对MDA-MB-231细胞的迁移数量进行计数。

1.5 细胞侵袭实验

取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，经2%FBS饥饿处理1天，消化、洗涤及离心处理后，采用无血清培养基重悬细胞；Transwell小室上室内铺基质胶，取MDA-MB-231细胞悬液加入Transwell小室上室，后续处理同“1.4”细胞迁移实验；采用吉姆萨染色处理后对MDA-MB-231迁移数目进行计数。

1.6 细胞黏附实验

取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，经消化、洗涤及离心处理后，采用无血清培养基制成单细胞悬液；采用20 μg/ml的FN包被48孔板，风干后采用PBS洗涤3次，每次20 min；取对数生长期MDA-MB-231细胞，分别接种于未经FN包被（无FN处理组）和经FN包被（FN处理组）的48孔板中，采用0、25、50、75 μg/ml的NRP2mAb分别处理接种于经FN包被的48孔板中的MDA-MB-231细胞30 min，PBS洗涤，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育30 min；经4%多聚甲醛固定后采用显微镜观察。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。对所有数据进行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NRP2mAb对MDA-MB-231细胞增殖的影响

NRP2mAb处理后，MDA-MB-231细胞的形态不规则，存在皱缩、脱落改变，细胞数量减少，细胞质颗粒数量增多。不同浓度NRP2mAb（25、50、75、100、200 μg/ml）处理24、48、72 h后，MDA-MB-231细胞的增殖抑制率比较，差异均有统计学意义（F=67.474、14.376、19.778，P＜ 0.05）；且随着NRP2mAb浓度的增高，MDA-MB-231细胞的增殖抑制率均逐渐增高；但100μg/ml和 200μg/ml NRP2mAb处理24、48、72 h后，MDA-MB-231细胞的增殖抑制率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。随着NRP2mAb作用时间的延长，乳腺癌细胞的增殖抑制率逐渐增高；NRP2mAb处理24、48、72 h 后，同一浓度 NRP2mAb（25、50、75 μg/ml）处理的MDA-MB-231细胞的增殖抑制率比较，差异均有 统计学意义（F=19.116、6.112、6.052，P＜0.05）。（表1）

表1 不同浓度NRP2mAb处理后MDA-MB-231细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

表1 不同浓度NRP2mAb处理后MDA-MB-231细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

注：a与25 μg/ml组比较，P＜0.05；b与50 μg/ml组比较，P＜0.05；c与75 μg/ml组比较，P＜0.05

NRP2mAb（μg/ml）24 h48 h72 h 256.75±2.1222.00±7.2923.62±7.15 5023.73±4.67a46.96±19.98a50.12±19.86a 7560.37±8.43a b73.63±14.26a b81.79±13.75a b 10088.96±6.64a b c90.00±6.06a b c93.54±7.01a b c 20091.29±6.59a b c91.37±6.59a b c97.08±4.20a b c

2.2 NRP2mAb对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭能力的影响

不同浓度NRP2mAb（0、25、50、75 μg/ml）处理后，MDA-MB-231细胞的迁移数目、侵袭数目比较，差异均有统计学意义（F=168.295、333.602，P＜0.01）；且随着NRP2mAb浓度增高，MDA-MB-231细胞的迁移数目和侵袭数目均逐渐减少，组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同浓度NRP2mAb处理后MDA-MB-231细胞迁移和侵袭情况的比较（±s）

表2 不同浓度NRP2mAb处理后MDA-MB-231细胞迁移和侵袭情况的比较（±s）

注：a与0 μg/ml组比较，P＜0.05；b与25 μg/ml组比较，P＜0.05；c与50 μg/ml组比较，P＜0.05

NRP2mAb（μg/ml） 迁移数目 侵袭数目0 245.2±35.2232.8±33.1 25167.2±42.5a97.5±22.5a 50104.5±17.6a b72.4±15.4a b 7568.1±9.1a b c48.6±10.8a b c

2.3 NRP2mAb对MDA-MB-231细胞黏附能力的影响

无FN处理组和不同浓度NRP2mAb处理后FN处理组MDA-MB-231细胞的黏附率比较，差异有统计学意义（F=53.046，P＜0.01）；与无FN处理组比较，0 μg/ml NRP2mAb处理的FN处理组MDA-MB-231细胞的黏附率增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；FN处理组中，随着NRP2mAb浓度（0、25、50、75 μg/ml）的增加，MDA-MB-231细胞的黏附率逐渐降低，两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同浓度NRP2mAb处理后MDA-MB-231细胞黏附率的比较（%，±s）

表3 不同浓度NRP2mAb处理后MDA-MB-231细胞黏附率的比较（%，±s）

注：a与无FN处理组比较，P＜0.05；b与0 μg/ml组比较，P＜0.05；c与25 μg/ml组比较，P＜0.05；d与50 μg/ml组比较，P＜0.05

组别 黏附率无FN处理组22.5±6.5 FN处理组0 μg/ml NRP2mAb45.5±11.8a 25 μg/ml NRP2mAb27.2±8.6b 50 μg/ml NRP2mAb22.5±5.1b c 75 μg/ml NRP2mAb18.1±4.8b c d

3 讨论

NRP2是神经纤毛黏连蛋白家族的重要成员之一，与神经纤毛蛋白 1（neuropilin 1，NRP1）具有44%的同源性[3]。作为一种跨膜蛋白，NRP2包括胞外区、跨膜区及胞内区3个部位。NRP2受体广泛表达于肿瘤细胞中，并参与了肿瘤细胞的生长、增殖、迁移、侵袭及凋亡过程[4-6]。已有研究显示，NRP2是重要的抗肿瘤靶点之一，NRP2与CXC趋化因子受体 4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）存在信号通路的部分重叠，在乳腺癌患者中，抑制NRP2表达可以下调肿瘤组织中CXCR4的表达，提示两者之间可能存在一定的相关性[7]。NRP2在乳腺癌细胞、肿瘤血管及淋巴管中均呈高表达，且明显高于正常组织[8-10]。

NRP2是近年来发现的一种VEGF受体，可以诱导血管内皮细胞的增殖和转移，促进肿瘤组织内新生毛细血管的生成[11]。乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附是导致乳腺癌患者死亡的重要原因，研究表明，下调NRP2表达可能抑制乳腺癌细胞的增殖，减少肿瘤新血管生成[12]。正常生长的乳腺癌细胞的形态清晰，贴壁性较高。本研究结果显示，NRP2mAb处理后，MDA-MB-231细胞的形态不规则，细胞数量减少、边缘皱缩、细胞间隙增大、细胞质颗粒增多及细胞脱落，表明NRP2mAb能够明显抑制乳腺癌细胞的增殖；同时本研究还发现，随着NRP2mAb浓度的增高（25、50、75、100、200 μg/ml），MDA-MB-231细胞的增殖抑制率均逐渐增高；但 100 μg/ml和 200 μg/ml NRP2mAb 处理24、48、72 h后，MDA-MB-231细胞的增殖抑制率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；表明高浓度（100～200 μg/ml）NRP2mAb 可以明显抑制乳腺癌细胞的增殖。

NRP2mAb对乳腺癌细胞的抑制作用还表现在对肿瘤细胞迁移及侵袭的作用[13]，本研究结果显示，不同浓度 NRP2mAb（0、25、50、75 μg/ml）处理后，MDA-MB-231细胞的迁移数目和侵袭数目比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；且随着NRP2mAb浓度的增高，MDA-MB-231细胞的迁移数目和侵袭数目均逐渐减少（P＜0.05）。表明NRP2mAb能够明显抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭，且其抑制程度具有明显的浓度依赖性。究其原因可能为NRP2mAb通过阻止Smad2/3的磷酸化过程而抑制乳腺癌细胞的增殖，而通过下调基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表达，干扰乳腺癌细胞的迁移及侵袭过程。

FN能够提高乳腺癌细胞的黏附能力，使肿瘤细胞聚集和黏附，形态饱满，贴壁性好。本研究结果显示，与无FN处理组比较，0 μg/ml NRP2mAb处理后FN处理组MDA-MB-231细胞的黏附率增高（P＜0.05）；FN处理组中，随着NRP2mAb浓度（0、25、50、75 μg/ml）的增加，MDA-MB-231细胞的黏附率逐渐降低（P＜0.05）。表明FN可以提高MDA-MB-231细胞的黏附能力，而NRP2mAb可以抑制MDA-MB-231细胞的黏附能力，且该作用具有浓度依赖性，随NRP2mAb浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。采用NRP2mAb处理后，乳腺癌细胞的形态学发生明显改变，呈现不同程度皱缩而形态不规则，并存在一定的脱落现象。NRP2mAb主要通过抑制乳腺癌细胞应力纤维的形成、减少肿瘤细胞间交联作用而抑制其黏附过程，而NRP2mAb对整合素α5β3及黏着斑激酶的抑制作用是该作用的重要环节[12,14]。

综上所述，NRP2mAb对乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及黏附能力均有抑制作用，并且具有浓度依赖性。