miRNA-34a 通过靶向调控HGF 在喉癌中的作用及临床意义

徐杨斌，洪艺云，李慧凤，朱忠寿，刘平

福建医科大学附属宁德市医院耳鼻咽喉科，福建 宁德 352000

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，其中93%以上为鳞状细胞癌，近年来喉癌的发病率呈增长趋势，占全身肿瘤的1%～5%[1]。喉癌的发生和发展是多因素、多基因、多步骤参与的过程，其发生可能与吸烟、饮酒、慢性炎症、环境污染和生物因素有关。目前外科手术和放疗是喉癌的主要治疗方式，虽然治疗技术有了较大进展，但由于喉癌早期症状不明显，因此早期诊断和治疗仍存在困难。加强对喉癌发生发展机制的研究，发现新的生物标志物已成为当前研究的热点之一[2]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一种单链非编码小分子RNA，可调控多种细胞的增殖、分化和凋亡过程，并在肿瘤的发展过程中具有重要的调控作用[3]。miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关，具有成为肿瘤标志物的潜力。有报道显示，miRNA-25和miRNA-221在喉癌中表达异常[4-5]，miRNA-301a在喉癌中高表达，通过对SMAD4的调控促进喉癌细胞的增殖[6]。miRNA-375可抑制靶基因PDPK1的表达，从而促进喉癌细胞的凋亡[7]。近年来的研究显示，miRNA-34a可调控多种肿瘤细胞的增殖、凋亡及转移，通过作用于多种靶基因发挥抑癌作用[8]。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一种分泌型肝素亲和糖蛋白，与肝素及硫酸软骨素具有高度亲和力，HGF/c-Met信号通路是由配体分子HGF作用于特异性受体c-Met，引起一系列信号转导蛋白的酶促反应，促发相应生物学效应的信号传递路径。肿瘤的侵袭、转移和血管生成与HGF/c-Met信号通路密切相关。miRNA-34a与喉癌的关系目前尚不明确，本研究检测miRNA-34a在喉癌患者中的表达情况，分析其对Hep-2细胞增殖、迁移及周期的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年6月至2019年3月于福建医科大学附属宁德市医院治疗的63例喉癌患者。所有患者均经病理诊断为喉鳞状细胞癌，术前未接受放化疗。收集喉癌患者的喉癌组织63例和远离手术阴性切缘的癌旁正常组织63例，于-80℃冰箱保存。

1.2 细胞培养与转染

使用含10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的 RPMI1640 培养基于 5%CO2、37℃条件下培养Hep-2细胞。将Hep-2细胞分为miRNA-NC组、miRNA-34a mimics组及miRNA-34a mimics+HGF组，各组按照说明书分别转染negative control miRNA mimics、miRNA-34a mimics及miRNA-34a mimics+HGF。

1.3 荧光素酶报告基因检测

构建HGF野生型3'-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-HGF-wt，并以pMIR-HGF-wt质粒为模板，利用聚合酶链反应搭桥法构建其潜在结合位点突变型报告基因质粒pMIR-HGF-Mut。将构建的pMIR-HGF-Wt质粒、pMIR-HGF-Mut质粒与miRNA-34a mimics和negative control miRNA mimics共转染进Hep-2细胞中。转染24 h后，去除培养基，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞3次，弃去PBS，每孔中加入100 μl被动裂解液（passive lysis buffer，PLB），室温下将培养板置于平板摇床上，轻微晃动15 min。待细胞裂解后，将每组20 μl样本转移至发光用96孔板上，并置于酶标仪的检测板上，设置自动进样器1和2分别分装100 μl的LARⅡ和Stop&Glo试剂。测量时，使用1～2 s延迟和5～10 s读数。如此循环操作直至所有样本检测完毕。使用酶标仪配套软件进行结果分析。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。实验重复3次。

1.4 实时定量聚合酶链反应检测miRNA-34a的表达水平

取喉癌组织和癌旁正常组织，按照Trizol试剂盒说明书中的步骤提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA进行逆转录，合成cDNA。采用实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒检测miRNA-34a的表达水平。实验重复3次。

1.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测HGF蛋白表达

miRNA-NC组、miRNA-34a mimics组Hep-2细胞转染36 h后，采用IP裂解液收集细胞。按照Western blot操作流程检测HGF蛋白的表达水平。

1.6 CCK8检测细胞增殖

参照CCK8试剂盒说明书步骤进行检测，miRNANC组、miRNA-34a mimics组及miRNA-34a mimics+HGF组细胞转染24 h后，接种于96孔培养板，每孔加入10 μl CCK8，37 ℃培养2 h，酶标仪上于480 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值，计算细胞的增殖率。实验重复3次。

1.7 细胞划痕实验检测细胞迁移

miRNA-NC组、miRNA-34a mimics组及miRNA-34a mimics+HGF组细胞转染48 h后，将单细胞悬液接种于12孔细胞培养板。待细胞长成单层后弃去培养液，在每孔中央划出一个划痕，洗去死细胞后，显微镜下拍照。利用软件测量并计算培养24 h后细胞的迁移率。实验重复3次。

1.8 流式细胞术检测细胞周期

miRNA-NC组、miRNA-34a mimics组及miRNA-34a mimics+HGF组细胞转染48 h后，悬浮并收集培养后的细胞并应用70%乙醇固定。加入碘化丙啶，4℃冰箱避光染色30 min，待样本形成单细胞悬液后，采用流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌组织和癌旁正常组织中miRNA-34a表达情况的比较

qRT-PCR检测结果显示，喉癌组织中miRNA-34a的表达水平为（0.26±0.06），明显低于癌旁正常组织的（1.00±0.15），差异有统计学意义（t=42.335，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征喉癌患者喉癌组织中miRNA-34a 表达情况的比较

喉癌组织中miRNA-34a的表达水平为（0.26±0.06），以miRNA-34a表达水平≥0.26为高表达，＜0.26为低表达。63例患者中，miRNA-34a高表达24例，低表达39例。不同年龄、性别、分化程度、临床分期的喉癌患者喉癌组织中miRNA-34a的表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。无淋巴结转移的喉癌患者喉癌组织中miRNA-34a的高表达率明显高于有淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同临床特征喉癌患者喉癌组织中miRNA-34a表达情况的比较（n=63）

2.3 miRNA-34a对HGF的靶向调控

miRNA靶基因数据库预测结果显示，miRNA-34a与HGF的3'-UTR具有结合位点，HGF是miRNA-34a的潜在靶基因。为验证miRNA-34a与HGF的靶向关系，本研究构建了HGF野生型3'-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-HGF-wt及突变型报告基因质粒pMIR-HGF-Mut。将negative control miRNA mimics、miRNA-34a mimics和构建的 pMIR-HGF-wt质粒及pMIR-HGF-Mut质粒共转染进Hep-2细胞中，双荧光素酶检测结果显示，共转染miRNA-34a mimics和pMIR-HGF-wt细胞的荧光素酶活性为（4.56±0.52），明显低于miRNA-NC组的（19.25±1.17），差异有统计学意义（t=19.873，P＜0.01）。共转染miRNA-34a mimics和pMIR-HGF-Mut细胞的荧光素酶活性为（19.96±6.37），低于miRNA-NC组的（23.56±6.69），但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 miRNA-34a对HGF mRNA和蛋白表达的影响

qRT-PCR检测结果显示，miRNA-34a mimics组Hep-2细胞中HGFmRNA的表达水平为（0.41±0.05），明显低于miRNA-NC组的（1.00±0.16），差异有统计学意义（t=6.096，P＜0.01）。Western blot检测结果显示，miRNA-34a mimics组Hep-2细胞中HGF蛋白表达水平低于miRNA-NC组（图1）。

图1 Western blot检测HGF蛋白表达

2.5 miRNA-34a和HGF对细胞增殖、迁移及周期的影响

CCK8检测结果显示，miRNA-34a mimics组细胞的增殖率明显低于miRNA-NC组，miRNA-34a mimics+HGF组细胞的增殖率明显高于miRNA-34a mimics组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。流式细胞术检测结果显示，miRNA-34a mimics组S期细胞比例明显低于miRNA-NC组，miRNA-34a mimics+HGF组S期细胞比例明显高于miRNA-34a mimics组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。细胞划痕实验检测结果显示，miRNA-34a mimics组细胞迁移率明显低于miRNA-NC组，miRNA-34a mimics+HGF组细胞迁移率明显高于miRNA-34a mimics组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表2 不同组别Hep-2细胞增殖、迁移及周期情况的比较（±s）

表2 不同组别Hep-2细胞增殖、迁移及周期情况的比较（±s）

注：a与miRNA-NC组比较，P＜0.01；b与miRNA-34a mimics组比较，P＜0.01

指标增殖率（%）S期细胞比例（%）迁移率（%）0.59±0.08 11.36±0.62 21.06±1.15 0.36±0.01a 5.93±0.31a 17.03±0.64a 0.75±0.03a b 18.45±0.69a b 32.56±2.13a b miRNA-NC组miRNA-34a mimics组miRNA-34a mimics+HGF组

3 讨论

喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，其早期症状不明显，而肿瘤的复发和转移严重限制了治疗效果[9]。因此，研究喉癌发生发展的分子机制，寻找喉癌早期诊断的生物标志物对喉癌的早期治疗及预后具有重要意义[10]。目前的研究显示，许多特异性miRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的调控作用，具有成为肿瘤诊治靶点的潜力。miR-NA是一类高度保守的长度为21～23个核苷酸的单链非编码小分子RNA，其通过碱基配对的方式与靶基因的3'-UTR结合从而导致靶基因的mRNA降解[11]。miRNA参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等生物学行为，并作为促癌或抑癌基因参与肿瘤的发展过程。研究发现，通过抑制miRNA-21的表达可促进喉癌细胞的凋亡，抑制喉癌细胞的增殖和迁移[12]。Cao等[13]研究发现，miRNA-21、miRNA-93、miRNA-205和miRNA-708在喉癌组织中表达升高，miRNA-145和miRNA-125b在喉癌组织中表达降低。Yu等[14]研究发现，miRNA-206在喉癌组织中表达降低，且其表达水平与淋巴结转移呈负相关。这些研究结果表明miRNA的异常表达与喉癌的发展过程密切相关。

miRNA-34a是miRNA-34家族成员之一，近年来有研究显示，miRNA-34a可以抑制肺癌、结肠癌、胰腺癌的发展，在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用[15-17]。然而miRNA-34a对喉癌的影响目前鲜有报道。本研究采用qRT-PCR检测发现，miRNA-34a在喉癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，进一步分析发现，无淋巴结转移的喉癌患者喉癌组织中miRNA-34a的高表达率明显高于有淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（P＜0.01）。表明miRNA-34a可能与喉癌的发生发展具有一定的关系。

HGF是一种多功能的细胞因子，主要由成纤维细胞、巨噬细胞等间质细胞产生。HGF不仅参与调控多种组织器官的生长发育及修复，还能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，加速恶性肿瘤的远处转移，诱发肿瘤新生血管的形成，在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用。HGF主要通过与其受体c-Met形成HGF/c-Met信号通路，发挥生物学作用。HGF与c-Met受体的胞外区结合后，激活c-Met胞内酪氨酸激酶的活性并发生自身磷酸化，激活的c-Met使多种底物酪氨酸蛋白磷酸化，进而促发一系列生物学效应。HGF/c-Met信号通路不仅可调控正常细胞的黏附、分化和迁移，调节胚胎、肺、肾等器官的发育及组织损伤修复，还与肿瘤的生长和浸润密切相关。研究显示，HGF/c-Met参与了甲状腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、肝癌、头颈部肿瘤等多种恶性肿瘤的发生发展[18]。干扰HGF的表达或阻滞HGF/c-Met信号通路可抑制肿瘤的恶性转化、浸润及血管形成。Uchida等[19]研究发现，与健康人相比，HGF在口腔鳞状上皮细胞癌患者血清中的表达水平明显升高；与无淋巴结转移的患者相比，HGF在有淋巴结转移患者血清中的表达水平明显升高；正常喉黏膜组织中HGF低表达。Sawatsubashi等[20]研究发现，HGF/c-Met在喉鳞状上皮细胞癌及转移的淋巴结中均出现高表达。Yücel等[21]研究纳入60例声门上型喉癌患者，发现c-Met在90%的瘤体及83%的转移淋巴结中高表达。Jiang等[22]报道显示，NK4可通过与c-Met稳定结合且不活化c-Met从而竞争性抑制HGF，进而抑制其促进肿瘤发展的作用。本研究通过miRNA靶基因数据库预测HGF是miRNA-34a的潜在靶点之一，而荧光素酶报告基因结果验证了miRNA-34a能够与HGF的3'-UTR特异性结合。qRT-PCR和Western blot检测结果也显示，miRNA-34a可以抑制HGF的mRNA和蛋白表达。提示miRNA-34a可能通过靶向作用于HGF参与喉癌的发生发展过程。

肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡是肿瘤发展过程中重要的生物学行为。本研究通过CCK8法、细胞划痕实验及流式细胞术进一步分析了miRNA-34a和HGF对Hep-2细胞增殖、迁移及周期的影响。结果显示，与miRNA-NC组比较，miRNA-34a mimics组的细胞增殖率、迁移率及S期细胞比例均较低，然而这种变化会被HGF过表达逆转。表明miRNA-34a可通过抑制HGF的表达抑制喉癌细胞的增殖、迁移和S期细胞周期的聚集，在喉癌中发挥抑癌作用。

综上所述，miRNA-34a通过结合靶基因HGF的3'-UTR抑制其mRNA和蛋白表达，在喉癌的发生发展过程中发挥抑癌作用。miRNA-34a表达情况与喉癌的发生及发展密切相关，提示miRNA-34a可能成为喉癌诊断及治疗的潜在新靶点。