抑癌基因DNA异常甲基化与宫颈癌研究进展*

刘 贽 席金瓯夏剑波

宫颈癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，其发病率逐年上升，目前在女性恶性肿瘤中高居第二位[1,2]。研究发现，高危人乳头瘤病毒(High Risk HPV, HR-HPV)感染是宫颈上皮内瘤样病变(Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN)和宫颈癌发生的最重要危险因素[3]。但是HPV感染诱发宫颈癌变的分子生物学机制目前仍不明确。

表观遗传学是研究细胞核DNA序列不发生改变时，其基因结构的改变引起基因表达发生改变，主要方式有DNA甲基化、miRNA表达调控、组蛋白共价修饰等。DNA甲基化是其中最为常见的一种化学修饰过程，在表观遗传基因调控中起重要作用。近年来，借助全基因组的方法，如新一代基因测序技术的发展，已经让我们更全面地识别癌症中不同的甲基化基因，它们在宫颈癌的发生、发展过程中起到的作用也逐渐被重视[4,5]。

宫颈腺癌约占宫颈癌的15%-20%，较宫颈鳞癌不常见。近年来，宫颈腺癌发病率呈逐年上升趋势，但其诊治相对宫颈鳞癌困难，如能选择在宫颈腺癌中甲基化程度更显著的基因进行定量甲基化测试，就可以达到早发现、早治疗的实用价值。本文就抑癌基因DNA甲基化与宫颈癌，特别是宫颈腺癌关系的研究概况进行综述。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是一种由DNA甲基转移酶(DN-MT)介导的化学修饰，是将一个有活性的甲基基团共价结合到CpG二核苷酸胞嘧啶5’碳位上的过程。在人类基因中，CpG二核苷酸以两种形式存在：一种是以甲基化形式分散存在，约占70%；另一种以高度聚集状态存在，被称之为CpG岛，这类CpG岛富含CpG二核苷酸，一般位于外显子区和启动因子区，处于非甲基化状态。但在肿瘤细胞中却发生异常甲基化，导致抑癌基因转录失活和表达沉默，从而诱导正常细胞癌变，是肿瘤发生的重要因素之一。

2 抑癌基因DNA异常甲基化与宫颈癌

研究表明[6]，DNA 异常甲基化在肿瘤的发生中扮演了重要角色。异常甲基化可以干扰细胞抑癌基因，使得抑癌基因表达沉默，从而使细胞出现恶性增殖，异常的甲基化状态是肿瘤的重要特征。

2.1 配对盒基因1(PAX1)

配对盒基因在动物体内广泛存在，家族中共包括9个成员(PAX1-PAX9)。PAX家族基因在胚胎发育和器官形成中起重要作用，并可能在干细胞和成熟细胞中持续表达。特异性PAX蛋白能够维持干细胞的特性，参与实体瘤和血液癌的发生和发展[7]。

PAX1是PAX基因家族中的重要成员。早年研究发现[8]，PAX1在胚胎发育中起重要作用，是发育过程中重要的转录因子。同时，它也是一种重要的抑癌基因。2008年Lai等[9]报道，在宫颈癌组织中PAX1发生异常甲基化，其甲基化率达到94.4%。该研究证明，PAX1基因的甲基化和宫颈癌的早期发生密切相关，且它在CIN Ⅲ 及更高级别的宫颈病变时其甲基化程度更高(P<0.01)。Huang 等[10]定量检测了不同严重程度宫颈肿瘤患者宫颈刮片中的PAX1基因甲基化百分比，发现在14例浸润性癌的甲基化百分率达56.7%，显著高于正常宫颈组织和其它较轻病变组织(P<0.01)。Chang等[11]研究发现，在宫颈腺癌组织中，PAX1甲基化程度显著高于正常组(OR值：15.7；95% CI：7.0-40.6)。Kan等[12]研究也提示，PAX1作为单独指标用以检测CIN Ⅲ及以上病变时，其敏感性为86%，特异性为85%。PAX1作为宫颈癌筛查的生物标志物具有很大潜力。Xu等[13]定量分析了PAX1和LMX1A基因在宫颈癌中的甲基化情况，与LMX1A相比，甲基化的PAX1具有更强的癌症检测能力。Su等[14]的研究表明，PAX1与SET1B组蛋白H3K4甲基转移酶复合物c的协同作用激活了磷酸酶体，它负责维持宫颈上皮内激酶和磷酸酶之间的开关稳态，通过DNA甲基化，可能破坏这种平衡，导致癌症的发生。大量研究表明，PAX1甲基化是一种很有前途的宫颈癌生物标志物。

2.2 性别决定基因1(SOX1)

SOX是一类超基因家族，由大量具有HMG-box保守基序的基因组成。SOX1是其中的一员，它是一种抑癌基因，与多种肿瘤，如肝癌、肺癌的发生发展有关。Lai等[9]发现，SOX1在宫颈癌组织中的甲基化水平显著高于正常组织。早期研究表明，SOX1能作为肿瘤抑制物通过干扰Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌中发挥重要作用[15]。Chang等[11]的研究提示，在宫颈腺癌组织刮片中，SOX1甲基化水平较正常组织明显增高(OR值：32.1，95% CI：12.1-124.3)。2010 年Lai等[16]使用定量 PCR检测发现SOX1甲基化对于宫颈癌筛查意义重大。ROC 曲线表明，SOX1检测CIN Ⅲ及以上病变的敏感性为88%，特异性为82%，准确性为95%。Chang等[17]研究了55例非典型腺体细胞的宫颈病变患者，用SOX1甲基化检测诊断CIN Ⅲ 和子宫内膜复杂增生病变的敏感性为100%，特异性为52%。Rogeri等[18]研究发现，SOX1基因启动子区域的高甲基化与严重CIN的发生直接相关，SOX1的甲基化是CINⅡ及以上的独立预测因子。这些研究说明甲基化SOX1是检测CINⅢ和复杂增生病变的新生物标志物。

2.3 Ras相关区域家族1A基因 (RASSF1A)

RASSF1A位于人类染色体3p21.3上，是RAS关联域家族1 (RASSF1)的重要同源形式。它在细胞周期调控、微管稳定和细胞凋亡中发挥重要作用[19]。RASSF1A是一种肿瘤抑制基因，其启动子甲基化与多种癌症如胃癌、乳腺癌的发生相关[20]。有研究表明，RASSF1A参与Ras信号通路和微管稳定，在包括宫颈癌和前体细胞病变在内的多种人类肿瘤中高甲基化[21]。Kang等[22]研究提示,RASSF1A的甲基化频率在鳞癌和腺癌这两种常见宫颈癌中有较大差异。Wang等[23]研究表明，RASSF1A启动子甲基化在宫颈癌中的发生率明显高于CIN病变和非恶性组织。但是还有一些研究报道了RASSF1A启动子甲基化在宫颈癌中发生的频率低于10%[24]。Zheng等[25]对2001-2017年26篇报道文献进行了Meta分析，对RASSF1A基因启动子甲基化进行了研究，其结果表明：RASSF1A启动子甲基化与宫颈癌发生的年龄、HPV亚型和肿瘤分期无关，与肿瘤分级及淋巴结转移相关，高级别患者明显高于低级别患者，淋巴结转移患者明显高于无淋巴结转移患者。RASSF1A 基因启动子甲基化程度可以作为宫颈癌分子诊断、预后评估的重要指标。

2.4 ZNF582

ZNF582位于染色体19q13.43上，是ZNF家族的成员，包含1个KRAB-A-B域和9个锌指基序[26]。ZNF582在不同疾病亚型中持续异常甲基化，但其生物学功能还未完全研究清楚。有学者[27]用甲基化特异性PCR、定量MSP和亚硫酸氢盐测序验证宫颈肿瘤组织的甲基化状态与不同严重程度的宫颈损伤之间的相关性。结果显示：ZNF582在所有检测的肿瘤组织中全部出现甲基化，在宫颈刮片中甲基化程度与疾病严重程度显著相关(n=300，P<0.01)。证明了ZNF582是宫颈癌分子筛选的潜在生物标志物。2014年，Lin等[28]学者检测了230名在宫颈细胞学上被诊断为低级别鳞状上皮内病变(LSILs)的妇女，使用Logistic回归曲线分析评估了4个甲基化基因和HPV预测CIN Ⅲ+ 的能力。结果显示，在4个甲基化基因中，ZNF582是检测CINⅢ+最佳的生物标志物。并且甲基化ZNF582预测CINⅢ+的能力明显优于HPV检测。Liou等[29]研究发现，ZNF582 作为检测CINⅢ+的标记物，和HPV-HR检测联合应用时，敏感性和特异性分别为82.43%和81.55%。这就为我们提供了一种监测非典型细胞病变的有效手段，可以联合检测ZNF582与HPV-16/18基因分型，作为宫颈癌筛查手段，具有广阔的实用价值。

3 抑癌基因甲基化在宫颈癌诊治中的应用前景

据报道[3]，2018年全球估计有56万余例新增病例，311 365人死亡，超过90%的宫颈癌死亡患者发生在发展中国家。宫颈癌的病因复杂，DNA甲基化作为表观遗传学的重要组成部分，对其研究将加深对宫颈癌的认识。有研究[18,21,31,32]早已证明，抑癌基因的异常甲基化在宫颈癌发生的早期阶段已经出现，所以能作为宫颈病变早期诊断的标记物，如死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)、6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)、性别决定基因9 (SOX9)、hsa-miR-124、PAX1、RASSF1A、SOX1等。多项研究证实，HPV DNA和抑癌基因DNA甲基化的联合检测对CIN及宫颈癌的筛查和诊断的准确性优于单独的HPV DNA检测。在Lai等[9]的研究里，同时对宫颈拭子进行HPV和PAX1检测比单独进行 HPV检测提高了鳞状上皮内高度病变和鳞状细胞癌检测的敏感度(从60%提高到 80% )。DNA甲基化检测相对简单、便宜、可靠，HPV 筛查、细胞学监测联合抑癌基因DNA甲基化检测势必可以作为宫颈癌早期筛查的有效方法。

4 小结与展望

抑癌基因甲基化与宫颈癌之间存在着密切联系，宫颈癌甲基化标志物检测是未来的研究热点和方向。需要继续深入研究这类可以作为非侵袭性标志物的抑癌基因，为宫颈癌的早期筛查、诊断以及治疗方案的探索提供新方法和思路。