表没食子儿茶素没食子酸酯对肥胖的影响及其机制

尹建国，张社兵，彭道泉

（1.汕头大学医学院附属粤北人民医院心血管内科，广东 韶关 512026；2.中南大学湘雅二医院心血管内科，长沙 410011）

肥胖是个体摄入的能量大于消耗，多余能量转化为脂肪储存在脂肪细胞中的病理生理过程；肥胖与胰岛素抵抗、高脂血症、高血压密切相关，是动脉粥样硬化的危险因素之一。体内的脂肪组织可分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织。白色脂肪组织的主要功能是储存脂质，蓄积能量；棕色脂肪组织的主要功能是产热，调节体温，有减肥的作用。二者的主要区别在于棕色脂肪细胞线粒体中特异性表达解偶联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1），UCP1能使线粒体氧化与ATP生成解偶连，能量以热能的形式散发，因此也被称作“产热素”。有研究［1］表明，饮用绿茶有减肥的作用，绿茶的主要活性成分是EGCG，EGCG约占绿茶干重的30%～40%。但是EGCG减肥的确切机制不清，本研究通过观察EGCG对小鼠体质量的影响，进一步探讨EGCG对肥胖及脂肪细胞UCP1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

C57BL/6J雄性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司，高脂饲料购自上海福贝世亨生物医药有限公司；3T3-L1细胞为湘雅二医院心血管内科实验室保存；EGCG购自美国Sigma公司；RNA提取及反转录PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；UCP1、β-actin兔抗鼠一抗购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；其余试剂均为湘雅二医院心血管内科实验室提供。

1.2 小鼠的分组与干预

24只C57BL/6J小鼠正常饲料饲养1周后随机分为3组（每组8只）：对照组，予以高脂饮食；小剂量EGCG组，予以高脂饮食加50 mg/kg EGCG灌胃；高剂量EGCG组，予以高脂饮食加150 mg/kg EGCG灌胃。饲养16周后记录体质量，处死小鼠，分离腹部脂肪组织。

1.3 细胞培养与干预

3T3-L1细胞复苏后，用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基置于含5%CO2、37 ℃、湿度100%的无菌培养箱中培养。细胞状态良好后计数随机分组，每组1.5×106个细胞，在含胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中加入不同浓度（0、20、100 μmol/L）EGCG诱导分化为脂肪细胞，8 d后3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞。

1.4 Western blotting检测UCP1表达

小鼠脂肪组织及分组干预的3T3-L1脂肪细胞裂解高速离心后取上清液，BCA法测蛋白浓度。取50 μg上样，经SDS-PAGE电泳后蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST溶液浸泡封闭2 h，加入1∶1 000的UCP1一抗，4 ℃孵育过夜。次日PBST液漂洗3次，相应稀释后二抗室温孵育2 h，再用PBST液漂洗3次。ECL化学发光显影，在柯达化学发光成像仪中自动显影。用图像分析软件进行灰度值分析，测得的各目的蛋白的灰度值与相应内参蛋白条带灰度值的比值即为该蛋白的相对表达量。

1.5 反转录PCR检测UCP1 mRNA的表达

按照试剂盒说明书提取小鼠脂肪组织及3T3-L1分化脂肪细胞RNA，行反转录PCR检测UCP1mRNA的表达水平。小鼠UCP1引物序列：正义 链5’-GCCTTCAGATCCAAGGTGAA-3’，反 义 链5’-TAAGCCGGCTGAGATCTTGT-3’。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据用±s表示，数据均进行正态性分析，不符合正态分布的变量均先经对数转换后，再作进一步统计分析。2组均数的比较采用独立样本t检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG对小鼠体质量的影响

3组小鼠饲养16周后，对照组、小剂量EGCG组、高剂量EGCG组小鼠体质量分别为（46.3±3.1）、（39.7±2.8）、（35.6±2.7）g；与对照组比较，小剂量EGCG组和高剂量EGCG组小鼠体质量减轻（P＜0.01）；且高剂量EGCG组小鼠体质量较EGCG低剂量组进一步减轻（P＜ 0.05）。

2.2 EGCG对小鼠脂肪组织UCP1蛋白表达的影响

与对照组比较，小剂量EGCG组和高剂量EGCG组小鼠腹部脂肪组织中UCP1蛋白表达明显升高（P＜ 0.01）；且高剂量EGCG组UCP1蛋白表达较EGCG低剂量组明显增加（P＜ 0.01）。见图1。

2.3 EGCG对3T3-L1来源脂肪细胞UCP1蛋白表达的影响

与对照组比较，20和100 μmol/L EGCG组3T3-L1来源脂肪细胞中UCP1表达明显增加（P＜ 0.01）；随EGCG浓度升高，UCP1表达呈上升趋势（P＜ 0.01），见图2。

2.4 EGCG对小鼠腹部脂肪组织及3T3-L1来源脂肪细胞UCP1 mRNA表达的影响

在小鼠腹部脂肪组织中，与对照组比较，小剂量EGCG组和高剂量EGCG组UCP1mRNA表达明显上调（P＜ 0.01）。在3T3-L1来源脂肪细胞中，与对照组比 较，20和100 μmol/L EGCG组UCP1mRNA表达明显上调（P＜ 0.01）。见图3。

3 讨论

图1 EGCG对小鼠脂肪组织UCP1蛋白表达的影响Fig.1 Effect of EGCG on UCP1 protein expression in adipose tissue

图2 EGCG对3T3-L1来源脂肪细胞UCP1蛋白表达的影响Fig.2 Effect of EGCG on UCP1 protein expression in 3T3-L1-derived adipocytes

图3 EGCG对小鼠腹部脂肪组织及3T3-L1来源脂肪细胞UCP1 mRNA表达的影响Fig.3 Effect of EGCG on UCP1mRNA expression in mouse adipose tissue and 3T3-L1-derived adipocytes

绿茶是全世界广受欢迎的饮料，绿茶有抗氧化、抗动脉粥样硬化、降低胆固醇、减轻体质量、改善胰岛素抵抗、减轻肝脏脂质沉积等作用［2-6］。研究［7］显示，绿茶饮用量与体脂含量及腰围呈负相关。EGCG是绿茶的主要活性成分，EGCG可通过增加脂质排泄，减少脂肪吸收，抑制脂肪合成酶活性减少脂肪合成，促进胆固醇逆转运及其从肠道排泄，激活交感神经活性促进脂肪氧化分解等多个环节调控脂质代谢，减轻体质量。单纯性肥胖主要是机体摄入能量大于消耗，能量以脂肪的形式在体内蓄积，这种脂肪组织是白色脂肪组织。目前认为白色脂肪组织不是单纯能量蓄积库，同时也能分泌促炎性细胞因子，如白细胞介素-6、肿 瘤 坏 死 因子-α、纤溶酶原激活物抑制剂-1等。这些促炎性细胞因子促进动脉粥样硬化、胰岛素抵抗等病理生理过程的发生发展。在人体婴幼儿期及其他小型哺乳动物体内存在另外一种脂肪组织——棕色脂肪组织，棕色脂肪组织储存脂质的能力有限，高表达UCP1，其主要功能是产热、调节体温，促进脂肪组织细胞表型转化，促进UCP1表达，增加脂肪氧化与ATP生成解偶连。有研究［8］表明，EGCG能在白色脂肪细胞上诱导与棕色脂肪细胞相关的基因表达，这是EGCG抗肥胖的作用机制之一。但目前关于EGCG对UCP1的影响研究较少。

本研究结果显示，EGCG能上调3T3-L1来源脂肪细胞UCP1的转录表达，促进白色脂肪细胞的表型向棕色脂肪细胞转化，UCP1转录表达上调能促进脂肪细胞脂肪氧化与ATP生成解偶连，增加热能的产生，促进能量的消耗。同时在小鼠体内证实，EGCG能上调脂肪细胞UCP1的转录表达，减轻肥胖小鼠的体质量。综上所述，本研究首次发现EGCG通过上调UCP1转录表达，从而减轻肥胖小鼠的体质量，这为认识绿茶的减肥机制提供科学依据，同时为减肥产品的开发提供思路。