自主设计试剂瓶插管改善血清CO2检测质量的研究

满冬亮，程仕彤，康辉

（中国医科大学附属第一医院检验科，沈阳 110001）

高检测速度的全自动分析仪在同时检测多个项目的过程中，试剂仓高速重复旋转和停止的动作可加速空气进入试剂瓶，对检测结果有较大的影响。我科实验室目前使用的全自动分析仪配套试剂瓶由于缺乏隔绝空气的装置，导致分析仪连续工作一段时间后，其检测的血清中二氧化碳（carbon dioxide，CO2）结果受到影响。针对上述问题，我科实验室自主改良设计了一种试剂瓶插管（实用新型专利：ZL 2016 2 0396761.8），本研究拟探讨该装置对全自动分析仪检测血清CO2结果的改善情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：瑞士罗氏公司配套CO2校准品及检测试剂盒，美国伯乐公司生化多项液态质控品2水平、3水平（批号45680），生化多项液态质控品2水平、3水平（批号45700）。

1.1.2 仪器：瑞士罗氏公司Cobas 8000全自动生化分析仪C701检测模块，台湾衡欣公司CO2检测仪AZ77535，自主设计试剂瓶插管。

1.1.3 样品：收集40例我院门诊及住院患者新鲜血清，无溶血、乳糜、黄疸，样本量充足。其中，50%数量的样本CO2浓度在参考区间之外，其余50%的样本CO2浓度在参考区间之内，且样本CO2浓度尽量覆盖整个CO2检测试剂盒线性范围。

1.2 方法

取2瓶新开瓶的罗氏配套CO2检测试剂盒，其中1瓶试剂盒作为原厂瓶，另外1瓶插入试剂瓶插管的试剂盒作为改良瓶，将2瓶试剂同时加载在罗氏全自动生化分析仪同一检测模块同一试剂仓中的相邻位置上，使用新开瓶CO2校准品同时校准原厂瓶和改良瓶试剂，此时生化分析仪刚开始运行，记为运转0 h，在此时间用原厂瓶和改良瓶同时检测日常工作用质控品（美国伯乐批号45700的生化多项液态质控品2水平、3水平）、2个水平的批内精密度（美国伯乐批号45680的生化多项液态质控品2水平、3水平）及双份测定40例新鲜血清样本。

运转0 h的样本全部检测完毕后，仪器正常进行日常工作，在分析仪运转2 h时用原厂瓶和改良瓶同时检测日常工作用质控品，作为试剂状态动态观察，此时质控数据记为运转2 h质控数据。分析仪运转4 h时，再用原厂瓶和改良瓶同时检测日常工作用质控品、2个水平的批内精密度及双份测定40例新鲜血清样本。

实验前对仪器进行常规维护与保养，保证仪器处于日常工作状态。实验中检测试剂仓周围空气CO2浓度。

1.3 数据收集与处理及结果判断

实验中检测并记录分析仪试剂仓周围空气CO2浓度值。直接收集质控数据，并判断是否在控。原厂瓶和改良瓶分别在0、4 h处连续检测20次质控样本，估计批内精密度并记录（±s），判断是否符合室内要求。原厂瓶和改良瓶分别在0、4 h检测的40例新鲜样本数据呈正态分布，采用多元方差分析处理数据，记录±s和P值，判断结果是否有统计学意义。原厂瓶和改良瓶0、4 h检测的40例新鲜样本数据经过离群值检查合格，相关系数r≥0.975或r2≥0.95估计数据范围合适，计算线性回归方程（y=bx+a），在医学决定水平判断系统误差（systemic error，SE），根据临床要求，将给定的CO2医学决定水平浓度xc代入回归方程，计算各个回归方程纵轴（y轴）与横轴（x轴）之间的SE，判断其是否被临床接受。

结果判断：（1）比较分析仪试剂仓周围空气CO2浓度与罗氏公司声明的限值，小于为合格，否则为不合格。（2）质控数据符合室内质控规则，则判断为在控，否则为失控。（3）连续检测的批内精密度数据符合室内精密度要求，变异系数（coefficient of variation，CV）＜1/4总误差则判断为符合，否则为不符合。（4）多元方差分析结果的判断，P＜ 0.05为差异有统计学意义。（5）以室内质量要求的允许总误差为判断依据，比较评估的SE≤允许1/2总误差则判断测定结果具有可比性，比较结果临床可以接受，否则为不可接受。

2 结果

2.1 分析仪试剂仓周围空气CO2浓度

分析仪试剂仓周围空气CO2浓度值约为850 ppm，远远高于正常空气中400 ppm左右的CO2浓度，但符合罗氏声明的需＜1 000 ppm的要求。

2.2 原厂瓶和改良瓶质控数据

原厂瓶检测的CO2室内质控品数值在仪器运转一段时间后即失控，改良瓶的检测结果则始终在控。见表1。

2.3 原厂瓶和改良瓶批内精密度

分别在分析仪运行0 h及4 h检测质控品得到原厂瓶和改良瓶批内精密度CV值，允许的1/4总误差（1/4×20%）为5%。CV值均＜5%，符合实验室针对血清CO2批内精密度的要求。各自的平均值、标准差、变异系数见表2。

2.4 多元方差分析

表1 室内质控数据及可接受范围（mmol/L）Tab.1 The quality control data and acceptable range of quality control（mmol/L）

原厂瓶 0 h与改良瓶0 h ［（19.21±5.87）mmol/L vs（19.03±5.84）mmol/L，P=0.890］、原厂瓶0 h与改良瓶4 h ［（19.21±5.87）mmol/L vs（21.16±6.00）mmol/L，P=0.146］以及改良瓶0 h与改良瓶4 h［（19.03±5.84）mmol/L vs（21.16±6.00）mmol/L，P=0.111］检测40例血清CO2浓度结果比较，差异均无统计学意义；原厂瓶0 h与原厂瓶4 h ［（19.21±5.87）mmol/L vs（23.42±6.19）mmol/L，P=0.003］检 测40例血清CO2浓度比较，差异有统计学意义。

2.5 临床可接受性判断

分别对原厂瓶0 h与改良瓶0 h、原厂瓶0 h与改良瓶4 h、改良瓶0 h与改良瓶4 h以及原厂瓶0 h与原厂瓶4 h检测患者血清CO2浓度比对结果进行回归分析，得到回归方程、标准误（Sy/x）、相关系数（r）。计算各个回归方程医学决定水平29 mmol/L处的SE，临床检测允许的SE＜1/2×总误差（20%），即10%，则在医学决定水平29 mmol/L处的SE界限即为2.9 mmol/L。计算的SE≤2.9 mmol/L，比较结果可接受，否则不可接受。不同试剂瓶及检测时间的回归方程及SE见表3。

表2 2个水平质控品批内精密度（n=20）Tab.2 The within-run precision of two level quality control materials（n=20）

表3 临床可接受性判断（n=40）Tab.3 Judgment of clinical acceptability（n=40）

3 讨论

CO2在血液中主要以HCO3-形式存在，大约占血液运输形式的95%，其余为少量物理溶解的CO2及极少量的其他形式存在的CO2，目前可以用电极法或酶法检测［1］。酶法是临床生化检验室检测血清中CO2的主要方法，优点是特异性强，能够检测出血清中所有形式的CO2，适用于全自动生化分析仪快速大批量的检测，但缺点是试剂稳定性不够，校准频繁。

虽然酶法能够检测出血清中所有形式的CO2，但是并未见到检测血清CO2结果偏高的报道，近年有报道依然是CO2试剂开瓶后不稳定会导致其检测结果偏低［2］。李广权［3］认为，应用酶法检测血清中CO2试剂不稳定的主要原因有2点，一是检测过程中试剂瓶口开放，易与空气中的CO2发生反应；其次是试剂反应系统中的酶具有不稳定性，如NADH容易被氧化分解，导致试剂空白值下降，检测线性范围变窄。陈洁等［4］尝试在试剂中加入葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，使NADH循环再生，从而提高试剂的稳定性。而杨文杰等［5］通过在试剂液面上方加入石蜡油，隔绝空气中CO2进入试剂，以及在试剂中加入乳酸锂及乳酸脱氢酶，使NADH再生这2种方式提高试剂的稳定性。何敏等［6］研究发现，为了更好地解决由于非检测原因导致的试剂中NADH消耗分解而引起的血清中CO2检测结果不稳定，无论进口试剂厂商还是国产试剂厂商都推出了改良型的浓缩酶法试剂盒，且检测性能良好。综上所述，应用酶法检测血清CO2结果不稳定主要是由于试剂盒中NADH被消耗导致检测线性范围变窄，由于该反应是检测吸光度减小的下降反应，故大量消耗NADH导致高值样本检测值偏低，但是自从各厂商推出了浓缩型的酶法试剂盒后，试剂盒中的NADH量充足，在厂商要求的有效期内，很少发生储存或存放在分析仪中的试剂盒由于空气进入或自身分解导致NADH大量减少，从而影响CO2检测的情况。

发生在本实验室的情况与上述报道的情况不同，本实验室血清CO2的检测试剂盒原理为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化碳酸氢根与磷酸烯醇丙酮酸反应，生成草酰乙酸和磷酸，草酰乙酸又在苹果酸脱氢酶的作用下生成苹果酸，导致NADH类似物的消耗，引起吸光度下降，该吸光度与被测样本中碳酸氢根的浓度呈正比。笔者发现使用罗氏新型检测模块检测血清CO2时，早上质控良好，且样本检测也未发现异常，但是当分析仪工作一段时间后就会出现CO2检测值偏高的现象，CO2质控值偏高，且样本检测值也都偏高。通过检查检测系统、质控品及质控范围、系统中可能存在的污染及空间环境后，发现除空气中CO2浓度偏高（达900 ppm左右），其他均未发现异常，故考虑可能是由于空气中CO2浓度过高，且罗氏新型检测模块试剂仓高速运转加速了空气中CO2进入到试剂盒中参与了反应，导致CO2检测值普遍偏高，这种情况在之前的旧检测系统未观察到是由于其检测速度不够快，试剂仓运转速度不够高，空气中CO2进入到试剂盒中较慢，故对结果影响较小。罗氏公司发出的通告也证实了这一点，通告中明确了分析仪试剂仓运转使空气中过高浓度的CO2进入到开放的试剂中，导致患者样本检测结果偏高，建议控制环境中CO2浓度在1 000 ppm以下，发现检测结果偏高时应立即执行空白校准及增加质控频率，更换试剂盒包装规格。通过实际检测发现，本实验室空气中CO2浓度虽然确实高于正常空气中CO2浓度，但都在1 000 ppm以下，符合试剂厂商要求。然而，实际操作中还是发现无论厂商给出的解决方案还是文献报道的方法，均不能实施或不能彻底解决CO2检测值偏高的问题，故本实验室自主设计了试剂瓶插管，拟通过延缓空气中CO2进入试剂瓶来达到改善CO2检测质量的目的，并进行了相关研究。

本研究中检测到分析仪试剂仓周围空气CO2浓度在850 ppm左右，未插入试剂瓶插管的原厂瓶在分析仪运转2 h后质控即失控，而插入试剂瓶插管的改良瓶的质控未发生失控，说明空气中CO2浓度虽然符合厂商＜1 000 ppm的要求，但原厂瓶在高CO2浓度环境中检测质控品CO2会受到明显影响，而改良瓶改善效果明显。接下来通过估算批内精密度调查造成检测质控品CO2偏高的误差来源是否主要来自随机误差，结果显示，分析仪运转0 h、4 h原厂瓶和改良瓶检测质控品得到的批内精密度均远小于室内精密度要求，说明检测结果偏高的误差来源并不主要来自随机误差；统计学分析及临床可接受性判断结果显示，原厂瓶0 h与原厂瓶4 h检测40例患者血清CO2差异有统计学意义（P ＜ 0.05），比对结果误差在临床上不可接受，且误差主要为系统误差，而原厂瓶0 h与改良瓶0 h、原厂瓶0 h与改良瓶4 h以及改良瓶0 h与改良瓶4 h检测40例患者血清CO2，差异均没有统计学意义（P ＞ 0.05），比对结果SE在临床上都可以接受，说明改良瓶在检测样本CO2方面虽也存在SE，但是改善检测质量效果明显。

综上所述，环境CO2浓度符合厂商要求的情况下，其新型分析仪检测血清CO2结果偏高是由分析仪试剂仓高速运转使空气中高浓度的CO2进入到开放瓶口的试剂瓶中导致，本实验室自主设计的试剂瓶插管可以有效延缓空气中的CO2进入试剂瓶，减小因空气中CO2参与反应而产生的SE，从而改善检测质量，使血清CO2检测结果更为准确。