长链非编码RNA RP11-110G21.1在结肠癌中的表达及其机制研究

曹晖，张申，刘琦，顾越雷

结肠癌是胃肠道中常见恶性肿瘤，近年来随饮食结构、生活习惯的变化，结肠癌发生率不断增加。结肠癌的发生是多种癌基因、抑癌基因参与调控的疾病，其病理机制尚未完全阐明[1-3]。长链非编码RNA(long chain non-coding RNA，lncRNA)是包含大于200个核苷酸但不具有蛋白编码能力的RNA分子，在X染色体沉默、基因组印记、核内运输等多种调控过程中发挥重要作用[4-6]。关于lncRNA在肿瘤发生发展及预后判断中的作用研究日益增多。前期研究通过lncRNA芯片发现，lncRNA RP11-110G21.1在结肠癌组织标本中异常表达，然而有关结肠癌组织中lncRNA RP11-110G21.1表达的临床意义未见研究。因此本研究通过观察结肠癌组织及其癌旁组织lncRNA RP11-110G21.1表达差异，并分析其表达与临床病理参数及预后的关系，以及检测沉默lncRNA RP11-110G21.1后对结肠癌细胞株增殖、迁移、侵袭的影响，从而研究lncRNA RP11-110G21.1在结肠癌中的表达情况及其在结肠癌发生发展中的作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2011年8月—2015年12月上海市松江区中心医院消化外科诊治结肠癌患者120例临床资料，所有病例均为初诊，其中男71例，女49例，年龄41～72(56.32±5.16)岁。普查便隐血阳性而无症状者56例，解暗红色血便伴消瘦28例，阵发性腹痛伴大便习惯改变19例，出现急性肠梗阻17例，均行肠镜检查明确诊断。合并症：心脏病(心律失常、心肌缺血)46例，糖尿病39例(血糖控制良好)，轻度慢性阻塞性肺疾病13例；有明确家族史者9例。有症状者出现症状到肠镜检查2周～9个月，中位数16周。所有病例均经肺部CT平扫、腹部增强CT或增强MR检查，排除远处转移。以手术过程中切除并冻存的结肠癌组织为结肠癌组，距癌组织边缘≥2 cm的癌旁组织为癌旁组织组，术前患者均未进行手术、放化疗及免疫治疗。排除标准：合并其他部位恶性肿瘤；具有严重肺功能损伤、大面积心肌梗死、严重糖尿病患者。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。患者术后定期通过门诊复查及电话随访形式随访，随访时间为3年。

1.2 观测指标与方法

1.2.1 qRT-PCR法检测结肠癌组织中lncRNA RP11-110G21.1表达： 应用TRI试剂提取结肠癌组织及其癌旁组织标本、人正常结肠上皮细胞(NCM460)、结肠癌细胞(LoVo)细胞株中的总RNA,应用Bio Rad逆转录试剂盒逆转录为cDNA，采用2×SYBR Green PCR MAsterMix，以cDNA为模板，进行qRT-PCR检测，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，lncRNA RP11-110G21.1正向引物：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，反向引物：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’；GAPDH正向引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。PCR反应条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环。采用2-△△Ct算法计算lncRNA RP11-110G21.1相对表达量。试验重复3次，取平均值。

1.2.2 细胞株及细胞培养：NCM460及LoVo细胞(购自美国ATCC公司)置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、饱和湿度、5%CO2条件下无菌恒温培养箱内培养。根据细胞生长情况定期换液与传代，3代后进行计数，进行细胞接种。

1.2.3 细胞转染：取对数期LoVo细胞以4×105/孔接种到细胞培养板，培养至细胞融合达到80%左右，更换为不含胎牛血清的RPMI 1640培养基。采用Lipofectamin 2000试剂进行转染，根据使用说明书，分别加入lncRNARP11-110G21.1NC(NC组)和lncRNARP11-110G21.1NC inhibitor(inhibitor组)，加入事先装有Opti-Medium 100 μl的 RNAasefree离心管中，然后加入Lipofectamin 2000试剂4 μl，将质粒与对应脂质体溶液混合，静置20 min，加入培养孔，另取装有Opti-Medium 100 μl的 RNAasefree离心管作为空白组。转染后48 h收集细胞，提取总RNA及总蛋白供后续使用。

1.2.4 CCK-8法检测下调lncRNA RP11-110G21.1表达对细胞增殖的影响：取各组细胞，离心弃上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，吹打混匀，制成细胞悬液，取细胞悬液10 μl，加入含RPMI 1640 1 ml EP管内，吹打混匀，取稀释细胞悬液10 μl，细胞计数板计数，以1.0×105个/ml细胞密度接种于12孔板，每孔100 μl，每组3个复孔。在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h，每孔加入浓度为1.5 mg/ml CCK-8 10 μl，培养 4 h后每孔加入 DMSO 150 μl，分别于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h读取吸光度值(OD)，绘制细胞生长曲线，测定时以未接种细胞只加培养基孔的为空白对照调零。

1.2.5 Transwell小室法检测下调lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞迁移、侵袭的影响：侵袭试验，收集各组细胞，在上层小室平铺稀释为1 μg/μl的Matrigel胶100 μl，37 ℃孵育4 h，计数后于无血清的DMEM培养液中重悬。上室加入细胞悬液100 μl ，下室加入600 μl 含10 % 胎牛血清的RPMI 1640完全培养基。37℃培养24 h后取出小室，用棉签擦除上层小室内的细胞和 Matrigel 胶，将细胞与1%多聚甲醛混合固定后用0.1 %结晶紫染色，用倒置显微镜[CG1-XDS-1B型，西化仪(北京)科技有限公司]随机选取5个视野并拍照，进行统计分析。实验重复3次，取平均值。迁移试验除不加入Matrigel胶外，其余步骤与侵袭试验完全相同。

2 结 果

2.1 2组lncRNA RP11-110G21.1表达比较 与癌旁组织lncRNA RP11-110G21.1表达水平(1.01±0.15)比较，结肠癌组织(1.73±0.24)显著升高(t=27.868，P=0.000)。

2.2 下调结肠癌细胞lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞增殖的影响 与NCM460细胞比较，LoVo细胞株lncRNA RP11-110G21.1表达显著升高(P<0.05)；与空白组、NC组比较，inhibitor组LoVo细胞lncRNA RP11-110G21.1显著降低(P<0.05)。CCK-8检测显示，转染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor后，LoVo细胞48 h后增殖较空白组与NC组显著降低(P<0.05)，3组间比较，差异有统计学意义(F=320.875，P<0.01)，见图1。

2.3 下调结肠癌细胞lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞迁移、侵袭的影响 与空白组比较，NC组迁移、侵袭细胞数差异无统计学意义(P>0.05)，inhibitor组迁移、侵袭细胞数显著降低(P<0.05)；与NC组比较，inhibitor组迁移、侵袭细胞数显著降低(P<0.05)，见图2(封3)、表1。

表1 Transwell试验检测下调lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞迁移、侵袭能力的影响个/HP)

注：与空白组比较，aP<0.05，与NC组比较，bP<0.05

注：A.NCM460、LoVo细胞株lncRNA RP11-110G21.1表达；B.细胞转染后LoVo细胞lncRNA RP11-110G21.1表达；C.下调lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞增殖的影响；与NCM460亚组比较，aP<0.05；与空白组比较，bP<0.05；与NC组比较，cP<0.05

图1 各组lncRNA RP11-110G21.1表达比较及下调lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞增殖的影响

2.4 不同临床病理特征患者中lncRNA RP11-110G21.1表达的变化 以lncRNA RP11-110G21.1表达水平的平均值1.73为界分为高表达亚组76例和低表达亚组44例，结果显示lncRNA RP11-110G21.1在不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤类型、淋巴结转移比较差异无统计学意义(P>0.05)，而在分化程度低、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期患者中的高表达比例高于分化程度中高、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，见表2。

2.5 结肠癌组织中lncRNA RP11-110G21.1表达与患者预后的关系 Kaplan-Meier结果显示，lncRNA RP11-110G21.1高表达亚组3年内存活率(27.6%)低于低表达亚组(61.4%)(χ2= 13.212，P= 0.000)，见图3。

图3 结肠癌患者lncRNA RP11-110G21.1表达生存曲线分析

2.6 结肠癌患者预后危险因素分析 多因素Logistic回归分析显示，分化程度低、TNM分期高、lncRNA RP11-110G21.1高表达是影响结肠癌患者不良预后的危险因素(P<0.05)，见表3。

3 讨 论

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌发病与高脂肪和低纤维饮食有关，近年来随饮食结构的变化，结肠癌发病率呈上升趋势。结肠癌早期症状不明显，中期也仅有腹胀、消化不良等症状，待发生腹痛、黏液便时已为中晚期，且伴随病灶转移，贻误最佳治疗时期[7-12]，因此提高结肠癌早期诊断率、寻找新的分子治疗靶标及转移、复发预警指标成为结肠癌研究中需解决的重大问题。结肠癌发生是多基因参与的过程，目前已发现多种促癌、抑癌基因参与结肠癌的癌变进程[13-17]。lncRNA是近年来发现的一类调控型RNA，成为肿瘤生物学领域的研究热点[18]。前期研究发现，lncRNA RP11-110G21.1在结肠癌组织标本中表达异常。而本研究结果显示，结肠癌组织中lncRNA RP11-110G21.1表达显著高于其癌旁组织，提示lncRNA RP11-110G21.1高表达与结肠癌的发生发展有关，且与分化程度、TNM分期及预后密切相关，此结果与上述研究结果基本一致，表明lncRNA RP11-110G21.1异常高表达在结肠癌的发生与转移过程中发挥重要作用，同时也说明lncRNA RP11-110G21.1高表达缩短患者生存时间，不利于结肠癌患者预后，因此检测lncRNA RP11-110G21.1水平可能对预测结肠癌的生物学行为与预后评估均具有一定参考价值。

表2 lncRNA RP11-110G21.1表达与结肠癌患者临床参数的关系 [例(%)]

表3 结肠癌患者不良预后影响因素Logistic分析

本研究进一步通过在结肠癌细胞系LoVo中转染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor使之表达下调，探讨下调lncRNA RP11-110G21.1表达对LoVo细胞增殖影响，结果表明，转染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor后24 h细胞增殖缓慢且3组间差异不显著，可能由细胞毒性影响转染导致，48 h后inhibitor组吸光度(OD)值显著低于空白组及NC组，同时发现下调lncRNA RP11-110G21.1表达可使结肠癌细胞侵袭、迁移能力显著降低。推测下调lncRNA RP11-110G21.1表达可抑制结肠癌癌细胞侵袭、转移，进一步说明lncRNA RP11-110G21.1可能通过影响结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力影响结肠癌患者预后，但是由于本研究仅初步探讨lncRNA RP11-110G21.1与结肠癌的关系，其内在具体机制还有待进一步深入分析。

综上所述，lncRNA RP11-110G21.1在结肠癌患者组织高表达，与患者临床分期等病理特征有关，检测其表达水平可能为预测患者肿瘤进展情况与评估预后提供参考；且降低lncRNA RP11-110G21.1表达可抑制结肠癌增殖、侵袭、迁移能力，可为提高结肠癌的诊疗效果提供新的研究思路。本研究存在一定不足之处，关于lncRNA RP11-110G21.1在结肠癌中的具体作用机制有待进一步研究。